منابع پایان نامه ارشد درباره لیپاز، فعالیت، تثبیت

میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM, Philips, XL30, Holland)استفاده شد.
شکل 3-11- میکروسکوپ الکترونی روبشی مورد استفاده در این تحقیق
3-4-4-تعیین توزیع اندازه ذرات نانوکیتوسان سنتز شده به روش تفرق نور با استفاده از دستگاه زتا سایزر:
از دستگاه زتا سایزر جهت اندازهگیری توزیع اندازه ذرات در محدوده نانو (1نانومتر تا 5میکرومتر)، اندازهگیری قطر هیدرودینامیکی ذرات کیتوسان پیوند عرضی شده، وزن مولکولی پلیمرها، و زتاپتانسیل مجهز به سیستم Auto Titrator با قابلیت تعیین Isoelectric Point استفاده میشود. در این مطالعه به منظور بررسی و تعیین اندازه ذرات نانوکیتوسان از دستگاه زتا سایزر مدل(Zetameter,3000 HS,Malvern, England) استفاده شد. اندازه متوسط نانوذرات در نمونههای آبی در دمای °C ?? و تحت زاویه آشکارسازی ?? درجه سنجیده میشود. هر نمونه ? بار اندازه گیری شده و میانگین آنها محاسبه میشود.
شکل 3-12- دستگاه زتاسایزر مورد استفاده در این تحقیق
3-4-5-طیف سنجی مادون قرمز(FT-IR) :
به منظور بررسی تغییرات موقعیت و شدت پیک گروه های عاملی در آنزیم لیپاز تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان، از طیف سنج مادون قرمز تبدیل فوریه Shiadzo, FTIR 1650 Spectrophotometr , Japan در محدوده طول موج
cm-1 4200-600 استفاده گردید.
3-4-6- اندازهگیری پروتئین تام به روش برادفورد69:
در روش برادفورد، ماده کوماسی بریلیانت G-250 به گروه های آمین پروتئینه شده اسیدهای آمینه در زنجیره پلی پپتیدی متصل میشود که ماکزیمم جذب نوری آن در طول موج nm 595 میباشد.
برای تهیه معرف برادفورد مطابق روش زیر ابتدا مقدار mg 100 کوماسی بریلیانت (CBB G-250) در ml 50 اتانول 95% حل گردید و بعد از افزودن ml 100 اسید فسفریک 85% ، معرف در بالن ژوژه یک لیتری با آب مقطر به حجم رسانده شد. جذب نوری این معرف در طول موج nm 465 می بایست در محدوده 1/0 ± 8/0 باشد.
برای انجام آزمایشml 5 از معرف را به لوله های استاندارد، نمونه و یا کنترل که حاوی 50 میکرولیتر از نمونه مورد نظر است اضافه نموده و بعد از 5 دقیقه جذب لوله ها در طول موج nm 595 قرائت شد.
این روش ساده سریع و تا غلظت mg/dl 150 ، خطی است.
3-4-7-اندازهگیری مقدار پروتئین (لیپاز) تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان:
برای محاسبه مقدار پروتئین تثبیت شده، میتوان مقدار کل پروتئین ( لیپاز) مورد استفاده در فرایند تثبیت را از مقدار پروتئین موجود در مایع رویی بعد از مراحل سانتریفیوژ و محلول های شستشو کم نمود.
مقدار پروتئین موجود در سوپرفانت و محلول های شستشو – مقدار پروتئین مورد استفاده برای تثبیت = مقدار پروتئین (لیپاز) تثبیت شده بر نانوذره کیتوسان
برای محاسبه راندمان تثبیت، میزان بازدهی فرآیند تثبیت از تقسیم مقدار کل پروتئین تثبیت شده بر مقدار کل پروتئین مورد استفاده در فرآیند تثبیت بدست میآید.
100× = درصد راندمان تثبیت70
3-4-8-اندازهگیری فعالیت آنزیم لیپاز:
تعیین فعالیت لیپاز با روشهای مختلف آزمایشگاهی امکانپذیر میباشد. یکی از پرکاربردترین روشها، استفاده از پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) به عنوان سوبسترای آنزیم لیپاز است. در این روش میزان آزاد شدن پارانیتروفنل (pNP) در نتیجه کاتالیز آنزیمی سوبسترای pNPP در طول موج 410 نانومتر ( محلول زرد رنگ) سنجیده میشود و بر اساس میزان جذب نوری قرائت شده در دستگاه اسپکتروفتومتر، فعالیت آنزیم لیپاز (U) محاسبه میشود.
3-3- واکنش سنجش فعالیت لیپاز
U فعالیت لیپاز است (u/mg) که با واحد اندازه گیری افزایش در جذب PNPسنجیده میشود. V مقدار حجم مورد آزمایش بر حسب (ml)، m مقدار لیپاز (mg) ، ضریب جذب مولی یا ضریب خاموشی PNP در 410 نانومتر ، d قطر لوله مسیر نور (cm) و تغییر جذب در هر دقیقه میباشد.
3-4-8-1-منحنی استاندارد فعالیت لیپاز:
نمودار (3-1) منحنی استاندارد فعالیت لیپاز را نشان می دهد که جهت سهولت محاسبات در تعیین فعالیت آنزیمی و مقدار میکرومول پارانیتروفنیل پالمیتات موجود در واکنش بر اساس میزان جذب خوانده شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در 410 نانومتر رسم شده است. از برازش خط نمودار (3-1) معادله زیر بدست میآید.
3-4
نمودار 3-1-منحنی استاندارد جهت تعیین فعالیت لیپاز در طول موج 410 نانومتر به روش اسپکتروفتومتری
اندازه گیری فعالیت لیپولیتیکی به دلیل اینکه لیپازها آنزیم های محلول در آب بوده در حالیکه سوبسترای آنها محلول در آب نمی باشد، بسیار مشکل است، روش های متفاوتی برای اندازه گیری فعالیت لیپاز بررسی و گزارش شده است. لذا در این مطالعه برای اندازه گیری فعالیت لیپاز از دو روش استفاده شد. با توجه به هم خوانی داده ها، نتایج روش دوم که در منابع بیشتر گزارش شده است مورد استفاده قرار گرفت.
3-4-8-2-روش اول: کیت پارس آزمون (کیت تشخیصی کمی Lipase DC ) در سرم یا پلاسما به روش فتو متریک:
بر اساس دو واکنش زیر آزمایش انجام شد:
1,2-o-Dilauryl-rac-glycero-3-glutaric acid (6-methylresorufin) ester
1,2-o-Dilauryl-rac-glycerin + Glutaric acid-(6-methylresorufin)-ester
Glutaric acid-(6-methylresorufin)-ester
Glutaric acid + Methylresorufin
جدول 3-1 و 3-2 محتویات و مقادیرمعرف یک و معرف دو را نشان میدهد:
جدول 3-1- محتویات معرف شماره یک در pH = 8
Goods buffer
40 mmol/I
Taurodesoxycholate
3.4 mmol/I
Desoxycholate
2.6 mmol/I
Calcium chloride
12 mmol/I
Colipase
1 mg/I
Detergent
Preservative
جدول 3-2- محتویات معرف شماره دو در pH = 4
Tartrate Buffer
1.5 mmol/I
Taurodesoxycholate
3.4 mmol/I
Color Substrate
0.13 mmol/I
Coemulgator
Stabilizer
Preservative
این آزمایش زمانی که فتومتر با بلانک هوا روی صفر تنظیم شده بود با شرایط طول موج 580 نانومتر، قطر کووت یک سانتی متر، دمای °C37 انجام شد.
جدول 3-3- روش کار اندازه گیری فعالیت لیپاز با استفاده از کیت پارس آزمون
بلانک
نمونه یا استاندارد
نمونه یا استاندارد

20 میکرولیتر
آب مقطر
20 میکرولیتر

محلول معرف شماره یک
1000 میکرولیتر
1000میکرولیتر
پس از مخلوط نمودن 1 تا 5 دقیقه در 37 درجه سانتی گراد انکوبه نموده و سپس معرف شماره 2 اضافه شد.
محلول معرف شماره دو
250 میکرولیتر
250 میکرولیتر
پس از مخلوط کردن، مقدار جذب نوری هر یک از نمونه ها، کالیبراتور و بلانک را بعد از 2 دقیقه انکوباسیون در 37 درجه سانتی گراد، در برابر هوا قرائت گردید و بلافاصله کورنومتر را بکار انداخته و دقیقا پس از 1 و 2 دقیقه اختلاف جذب نوری از دقیقه قبل تعیین شد.
برای محاسبه مقدار اختلافات جذب نوری پس از دقایق 1 و 2 را باهم جمع نموده و بر عدد 2 تقسیم کرده و میانگین تغییرات جذب نوری برای هریک از نمونه ها، کالیبراتور و بلانک از طریق فرمول زیر محاسبه شد.
3- 5 Lipase(U/I)=× Conc.Cal (U/I)
3-4-8-3-روش دوم: اندازهگیری فعالیت لیپاز با استفاده از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) :
در این روش از پارانیتروفنیل پالمیتات به عنوان سوبسترای آنزیم لیپاز، برای اندازه گیری فعالیت آنزیمی استفاده شد. این روش معتبر سریع و پرکاربرد است و محصول نهایی آن اسید چرب و پارانیتروفنل میباشد. پارانیتروفنل، زرد رنگ میباشد که در طول موج 400-410 نانومتر جذب نوری آن قرائت می شود. فعالیت را میتوان از مقایسه عدد جذب قرائت شده در طول موج 410 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر با منحنی استاندارد پارانیتروفنل بدست آورد ]40، 87، 88 و89[. منحنی استاندارد بر اساس غلظت های مختلف پارانیتروفنل شامل 1/0 ، 05/0، 01/0، 005/0 میلی مولار رسم شد.
به منظور سنجش فعالیت لیپاز در نمونه های مورد نظر، مقدار 900 میکرولیتر از سوبسترای pNPP و 100 میکرولیتر بافرفسفات M 1/0 وpH 4/7 در داخل هر یک از ویالهای اپندروف دربدار اضافه شد و به مدت 3 دقیقه در حمام آب در دمای 55 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و سپس 10 میکرولیتر از محلول های آنزیمی لیپاز قبل و بعد از تثبیت به ویالها اضافه شده و بعد از مخلوط شدن کامل با استفاده از شیکرلوله، مجددا ویالها در دمای °C 55 به مدت 5 دقیقه انکوبه شدند و سپس جذب نوری نمونه ها در طول موج 410 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید و با استفاده از منحنی استاندارد، فعالیت آنزیم لیپاز در نمونه ها تعیین شد.
3-4-9- بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان :
به منظور تعیین اثر دما بر میزان فعالیت آنزیم لیپاز قبل و بعد از تثبیت، نمونه های آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده بر روی نانو کیتوسان مطابق روش کار شرح داده شده و با استفاده از سوبسترای pNPP در دماهای 20، 30، 40، 50 و 60 درجه سانتی گراد در حمام آب انکوبه شدند و سپس جذب نمونه ها در طول موج 410 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد و فعالیت آنزیم لیپاز در نمونه های مورد نظر تعیین گردید.
3-4-10-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان:
تغییرات فعالیت آنزیم لیپاز قبل و بعد از تثبیت بر روی نانوذره کیتوسان مطابق روش کار و با استفاده از سوبسترای pNPP در هفت pH مختلف از 5 تا 8 (5، 5/5، 6، 5/6، 7، 5/7 و 8) مورد بررسی قرار گرفت.
3-4-11- بررسی پارامتر های سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان:
به منظور اندازهگیری پارامترهای سینتیکی شامل Vmax , Km آنزیمهای لیپاز آزاد و تثبیت شده بر روی نانو ذره کیتوسان از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) استفاده شد. غلظتهای سریال از سوبسترای pNPP در محدوده nm 5-1 برای هیدرولیز آنزیمی در دمای °C 40 و 7=pH بکار گرفته شد.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *