دانلود پایان نامه

آنها بر روی ژل آگارز الکتروفورز گردید. نمونه هایی برای RFLPانتخاب شدند که دارای یک باند واضح و مشخص بودند و نمونه های دارای اسمیر و شکستگی کنارگذاشته شدند.

شکل (4-5):DNA های مناسب برای انجام RFLP
4-6- نتایج هضم آنزیمی(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس
قطعات DNA با وزن مولکولی در حدود 5/0 تا 25کیلو باز، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده PvuII بر روی ژل آگارز، الکتروفورز شدند(تصویر 4-5). در کنار نمونه ها از سایز مارکرDNA شماره 2 نشاندار با دیگوکسیژنین شرکت رش آلمان، برای تعیین اندازه باند ها استفاده شد.

تصویر(4_6): قطعات DNA ، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده Pvu II
M-سایز مارکر شماره 2رش آلمان- P- کنترل مثبت – ستون اول نمونه شماره 1753- ستون دوم نمونه شماره 1756- ستون سوم نمونه شماره 1760- ستون چهارم نمونه شماره 1761- ستون پنجم نمونه شماره 1762- ستون ششم نمونه شماره1763- ستون هفتم نمونه شماره 1764- ستون هشتم نمونه شماره 1772
4-7-نتایج ساترن بلاتینگ:
نتایج الگوهای به دست آمده با استفاده از روشهای فوق به شرح زیر میباشد:
الف- با مقایسه چشمی باندهای با وزن مولکولی بالا ( 6557 تا 23130 جفت باز) و با استفاده از نرم افزار

ژل پرو182، از 8 سویه هضم شده با آنزیم Pvu II، پس از RFLP و هیبرید شدن با پروب PGRS و آشکار سازی، تعداد 2 الگوی متفاوت به دست آمد که در تصویر 4-5 نشان داده شده است. الگوها با نامهای PP1 تاPP2 (P حرف اول ابتدای آنزیم Pvu II و P حرف دوم ابتدای پروب PGRS) نامگذاری گردید (جدول 4-1)

تصویر(4-7): RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب PGRS
M-سایز مارکر شماره 2رش آلمان- P- کنترل مثبت- ستون اول نمونه شماره 1753- ستون دوم نمونه شماره 1756- ستون سوم نمونه شماره 1760- ستون چهارم نمونه شماره 1761- ستون پنجم نمونه شماره 1762- ستون ششم نمونه شماره1763- ستون هفتم نمونه شماره 1764- ستون هشتم نمونه شماره 1772
ب – با مقایسه چشمی باندهای با وزن مولکولی2027 الی23130 جفت باز و با استفاده از نرم افزار ژل پرو، از 8 سویه هضم شده با آنزیم Pvu II، پس از RFLP و هیبریدیزاسیون با پروب DR و آشکارسازی، 3 الگو به دست آمد، که با علامت اختصاری PD1 تاPD3 (حرف اول آنزیم Pvu II و حرف اول پروب مصرفی) نامگذاری گردید (تصویر 4-6).

تصویر(4-8):RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب DR
M-سایز مارکر شماره 2رش آلمان-P- کنترل مثبت- ستون اول نمونه شماره 1753- ستون دوم نمونه شماره 1756- ستون سوم نمونه شماره 1760- ستون چهارم نمونه شماره 1761- ستون پنجم نمونه شماره 1762- ستون ششم نمونه شماره1763- ستون هفتم نمونه شماره 1764- ستون هشتم نمونه شماره 1772
در الگوهای بدست آمده در این تحقیق با استفاده از آنزیم PvuIIو پروبهایPGRS و DR، از2 الگوی بدست آمده از8 جدایه هضم شده با آنزیم PvuII و هیبرید شده باPGRS ، بیشترین الگو مربوط به الگوی PP-1می‌باشد که این الگو کاملا شبیه به الگوی بدست آمده از مایکوباکتریوم بویسBCGاست، و از3 الگوی بدست آمده از8 جدایه هضم شده با آنزیم PvuII و هیبرید شده با پروب DR نشان داد که بیشترین الگو بدست آمده مربوط به PD-1می‌باشدکه این الگو کاملا شبیه به الگوی بدست آمده از مایکوباکتریوم بویسBCG است.
جدول 4-1- نمونههای مورد استفاده در این تحقیق به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونهها
ردیف
شماره
سویه
RFLP با آنزیم Pvu II
استان
شهرستان

پروب
PGRS
پروب DR

P
BCG
PP-1
PD.1
سویه استاندارد
1
Razi01753
PP-1
PD.1
مشهد
2
Razi01756
PP-1
PD.1
مشهد
3
Razi01760
PP-1
PD.1
مشهد
4
Razi01761
PP-2
PD.2
مشهد
5
Razi01762
PP-2
PD.1
مشهد
6
Razi01763
PP-2
PD.2
مشهد
7
Razi01764
PP-1
PD.1
مشهد
8
Razi01772
PP-1
PD.3
مشهد

فصل پنجم
نتیجه گیری و پیشنهادات

5-نتیجه گیری
سل که از دیرباز بعنوان یکی از معضلات زندگی بشریت شناخته شده است، در انسان و حیوانات توسط کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ایجادمی‌شود برای آگاهی از منابع آلودگی، مسیرهای انتقال، اپیدمیولوژی و تغییرات مولکولی عامل سل در گاو، در طی چند سال اخیر بررسی مولکولی سویه های مایکوباکتریوم بویس جدا شده از گاوهای توبرکولین مثبت و گاوهای سلی کشتار شده در کشتارگاه‌های سراسر کشور، تحقیقات و مطالعاتی صورت گرفته است. حیدرزاده، رفیعی و علوی(1388، 1392 و 1388)در ادامه مطالعات فوق، تحقیق حاضر در نظر دارد میزان تنوع ژنتیکی کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در استان خراسان را با استفاده ازتکنیکهای مولکولی مانند PCRو RFLP مورد بررسی قرار دهد.
از بین مایکوباکتریوم‏های گروه کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس که عامل ایجاد کننده سل در پستانداران می‏باشند مایکوباکتریوم بوویس بیشترین میزان میزبانی را بخود اختصاص می‏دهد. تاج بخش و طباطبایی(1366) محققان دریافتند که در بین اعضای گروه مایکوباکتریوم کمپلکس توبرکلوزیس100-85 درصد تشابه ژنومی وجود دارد. در حال حاضر تمایز بین گونه ایکمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس براساس مشخصات فتوتایپیک از جمله مورفولوژی کلنی، میزان رشد و انجام تست‏های بیوشیمیایی میسر می‏‏باشد که پس از کشت انجام می‏گیرند.
در حال حاضر طبق دستورالعملOIE و سازمان بهداشت جهانی، کشت و جداسازی
مایکوباکتریوم قطعی ترین روش تشخیص بیماری سل میباشد. میلان(2004) در روش استاندارد جداسازی مایکوباکتریوم، محیطهای لوانشتین جانسون به عنوان بهترین محیطها معرفی شده است. میلان(2004) در این تحقیق نیز از روش کشت در محیطهای لوانشتین جانسون گلیسرین دار، پیروات دار برای جداسازی مایکوباکتریوم از نمونههای ارسالی استفاده گردید. (میلان، 2004)
دراین تحقیق برای جداسازی DNA ازمایکوباکتریومها از روش استاندارد ارائه شده توسط ونسولینگن در دستورالعمل WHO درسال1993میلادی برای انگشت نگاری ژنومیمایکوباکتریومها استفاده شد. این دستورالعمل درسال2002میلادی نیزباتغییراتی مجددا ارائه شد وشناخته شده ترین روش استخراج DNAاز مایکوباکتری ها جهت استفاده در RFLPاست.(سراینو و همکاران، 1999)
بهرهمندی از تکنیکهای تایپینگ مولکولی مانند پلیمورفیسم قطعات به وسیله آنزیمهای محدود کننده(RFLP) در گلههایی که این بیماری در آنها شیوع دارد جهت تشخیص دقیقتر مواردی مانند راه انتقال و جستجوی ردپای بیماری بسیار مفید می باشد. همانگونه که در مبحث روش کار تحقیق حاضرنیز به آن اشاره شد، انتخاب آنزیم Pvu IIبرای هضم آنزیمی توصیهای بوده که در روش استاندارد ارائه شده توسط ون سولینگن در دستورالعمل WHO برای انگشت نگاری ژنومی کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ارائه شده است. (سراینو و همکاران، 1999)
در تحقیقات مولکولار اپیدمیولوژی سل گاوی برای جدایههای کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس از مارکرهای مختلف ژنتیکی استفاده میشود. دراین بین توالی های غنی از GC بنامPGRS و رونوشت های مستقیم DR به عنوان مارکرهایی سودمند در RFLP انواع سویه های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مورد استفاده قرار می گیرد. تکنیکهای مولکولی به کار رفته در این تحقیق همگی طبق توصیه OIE انتخاب گردیده و برای پلی مورفیسم مایکوباکتریوم بویس بالاترین تمایز را ایجاد مینماید. میلان(2004) به دلیل بزرگ بودن ژنوم مایکوباکتریومها بادارا بودن حدود 4/4 جفت بازتفسیرالگویRFLP به تنهائی وبدون هیبریداسیون مشکل میباشد، درحالیکه پس از انتقال DNAبه غشاء وهیبریداسیون باپروب وآشکارسازی، تفسیرامکانپذیرمیگردد.
همچنین دلیل انتخاب روشRFLP و هیبریداسیونDNA در مطالعه حاضر ارجحیتی است که این تکنیک بر سایر روشهای مولکولی در متمایز نمودن سویه های مایکوباکتریائی داراست. مثالهای زیر که به اختصار به آنها اشاره میگردد، شواهدی بر این انتخاب است.
تحقیقات زیر تجربیات محققین را در این خصوص نشان میدهد.
تکنیک انگشت‌نگاری DNA یا آنالیز به روش RFLP رایج‌ترین روش برای تقسیم‌بندی مایکوباکتریوم از نظر اپیدمیولوژی می‌باشد. از این روش عمدتاً برای تایپینگ اعضای کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس استفاده می‌شود. اساس کار تکنیک RFLP به این صورت است که رشته‌های DNA توسط آنزیم‌هایی به نام رستریکشن اندونوکلئاز هضم می‌گردند و بدین ترتیب به قطعاتی با طول‌های مختلف تبدیل می‌شوند که می‌توان این قطعات را بر مبنای میزان تحرک وابسته به اندازه آنها در یک ژل الکتروفورز تفکیک نمود.
گویال و همکاران در سال 1999 در غنا در یک تحقیق مقایسه‌ای که با دو روش اسپولیگوتایپینگ و RFLP انجام دادند، تعداد 16 الگو به روش اسپولیگوتایپینگ و25 الگو به روشRFLP را شناسایی کردند که نشان دهنده این است که روش انگشت نگاری ژنومی با استفاده ازRFLP تمایز بیشتری را نشان می‌دهد.(52)
همچنین زوماراگا در سال 1999 در جنوب امریکا طی یک تحقیق از روش های اسپولیگوتایپینگ وRFLP استفاده نمودو از تعداد154جدایه مایکوباکتریوم بویس با روش اسپولیگوتایپینگ تعداد 31 الگو و به روشRFLP43 الگوی متفاوت را بدست آورد.(سری واتسان و همکاران183، 1997)
در ادامه در تحقیق دیگری که در سال 2012 در دهوک عراق انجام پذیرفت تنوع ژنتیکی سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در بیماران مسلول با استفاده از سه روشIS6110–RFLP، اسپولیگوتایپینگ و VNTR مورد بررسی قرار گرفت که نتایج آن حاکی از تمایز بالای الگوهای بدست آمده به روش RFLP-IS6110 نسبت به دو روش دیگر بود.(78)
در جمع بندی نتایج تحقیقات فوق چنین نتیجه گیری می‌شود که با توجه به نحوه انجام روش‌های اسپولیگوتایپینگ وVNTRکه به PCR وابسته می باشند، این تکنیک ها راحت‌تر بوده وبرای تست اولیه، روش های مبتنی برPCR مناسب می‌باشند ولی نسبت به روشRFLPتمایزی کمتری را نشان می‌دهندزیرا قطعه کوچکی از ژنوم را مورد بررسی قرار می دهند و روشRFLPگستره بیشتری از کل ژنوم را نشان می دهد و برای شناسایی دقیق سویه‌ها و مشاهده پلی مورفیسم بین آنها روشRFLP یک روش استاندارد و توصیه شده توسطOIE وWHO می‌باشد. در نتیجه تکنیک کارآمدتر و قویتری می باشد.
در تحقیقی که در سال 2006 توسط مصوری و همکاران با عنوان ” بررسی پلی مورفیسم سویه های مایکوباکتریوم بویس جدا شده از نمونه های ارسالی به موسسه رازی به روشRFLP انجام گرفت تعداد 14 سویه مایکوباکتریوم بویس در ایران شناسایی شدند که بیشتر این سویه‌ها مربوط به استان‌های شمالی و غرب کشور بودند.(فرنیا، 1387)
در مطالعه علوی و همکاران در سال 1387برای تشخیص و تعیین هویت مولکولی مایکوباکتریوم،‌ جدایه‌های گاوی مایکوباکتریوم بویس از جدایه‌های انسانی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در ایران به روشPCR-RFLP و مقایسه آنها با 5 سویه استاندارد انجام پذیرفت و نتایج آن تعیین هویت سریع دو گونه از یکدیگر بود. شیمی(1376) استفاده از تکنیکPCR-RFLPیک روش سریع و دقیق جهت
شناسایی گونه مایکوباکتریوم بویسنسبت به سایرکمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس با استفاده از ژن کاذبی بنام oxy R می‌باشد که این قطعه ژن در نوکلوئید شماره 285 خود حاوی باز آدنین بوده اما در سایر کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس دارای باز گوانین میباشند. استفاده از این تکنیک برای شناسایی گونه مایکوباکتریوم بویس از کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در مناطق افریقا، امریکای جنوبی ومرکزی، جنوب شرق آسیا و سایر مناطق که انتقال مایکوباکتریوم بویس از حیوانات به انسان و ‌بعلکس می‌تواند رخ دهد، بسیار مفید خواهد بود. شیرانی (1385) در تحقیق حاضر نیز از روش فوق برای شناسایی گونه مایکوباکتریوم بویس استفاده شده است و نشان داد که بین نتایج آزمایشات بیوشیمیایی و تست های ملکولی 100% مطابقت وجود داد.
در تکنیکRFLP


دیدگاهتان را بنویسید