100 میلی لیتر آب مقطر رقیق شد. محلول در حرارت اتاق تا یکسال قابل نگهداری است.
• مخلوط SDS / پروتئیناز K
برای هر نمونه 5 میکرولیتر پروتئیناز K (10 میلی گرم پودر پروتئیناز K در 1 میلی لیتر آب مقطر) با 70 میکرولیتر SDS 10 % مخلوط و مصرف شد.
• محلول NaCl/CTAB
1/4 گرم نمک (مرک)، در 80 میلیلیتر آب مقطر حل شد. سپس 10 گرمCTAB در حال گردش به آن اضافه شد. محلول فوق تا 65 درجه سانتیگراد، گرم و حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانیده شد. محلول فوق را میتوان به مدت 6 ماه در هوای اتاق نگهداری نمود.
3_4_7_2_ کنترل و جمع آوری سلولهای باکتری رشد یافته
سطح لولههای حاوی کشت باکتریها در فواصل 24-72 ساعت پس از انکوباسیون، از نظر آلودگی احتمالی با سایر باکتریها بررسی و سپس هفتهای یکبار تا شش هفته کنترل میگردید. در حدود شش تا هشت هفته پس از انکوباسیون کلنیها به اندازه کافی رشد کرده بودند. سپس با استفاده از یک آنس پلاستیکی استریل تحت شرایط ایمن در زیر هود از سطح محیط کشت لونشتین جانسون حداقل به میزان یک لوپ کامل از کلنیهای باکتری برداشته و به آرامی در درون یک میکروتیوب حاوی 400 میکرولیتر بافر 152TE انتقال داده میشد. به منظور جلوگیری از تشکیل آئروسل و نیز آلودگی درب و سطح خارجی لولهها، اصول ایمنی به طور کامل رعایت میگردید.
سوسپانسیون حاصل به مدت 30-20 دقیقه جهت غیر فعال شدن سلولهای باکتری در دمای C° 80 قرار داده میشد. در صورتیکه مراحل استخراج DNA در همان روز ادامه نمییافت، سلولهای باکتری در یخچال و برای نگهداری طولانی مدت در دمای C° 20- نگهداری میشد.
3_4_7_3_ مراحل استخراج DNA
پروتکل زیر دستورالعملی است که توسط ون سولینگن و همکاران در سال 1997 تدوین و WHO آنرا برای استخراج DNA مایکوباکتریها توصیه نموده است. در مطالعه حاضر برای استخراج تمامی نمونهها، از این دستورالعمل پیروی گردید ون سولینگن(1996). برای استخراج DNA به ترتیب مراحل زیر انجام میگرفت.
1- به هر یک از میکروتیوبهای حاوی سوسپانسیون غلیظ و کشته شده مایکوباکتری 50 میکرولیتر لیزوزیم 10 mg/ml اضافه میشد و پس از ورتکس شدن، حداقل یکساعت یا ترجیحا یک شب در Cº 37 گرمخانه گذاری میگردیدند (در این تحقیق تمامی میکروتیوبها یک شب در انکوباتور شیکردار قرار داده میشدند).
2- 75 میکرولیتر مخلوط پروتئیناز K و SDS 10% 153 به هر میکروتیوب اضافه و خیلی کوتاه ورتکس شده و به مدت 10 دقیقه در Cº 65 انکوبه می گردید. طی این دو مرحله پیکره باکتریها توسط آنزیمهای لیزوزیم، پروتئیناز K و SDS از بین رفته و DNA باکتری آزاد میگردد. (در این تحقیق برای بدست آوردن حداکثر بازدهی، به مدت یک شبانه روز در 55 درجه سانتی گراد انکوباسیون انجام شد).
3- به میکروتیوبها 100 میکرولیتر NaCl 5 مولار اضافه میشد.
4- به هر میکروتیوب 100 میکرولیتر محلول154 CTAB/NaCl که قبلا به مدت 15 دقیقه در فور Cº65 قرار داده شده بود (تا سیال گردد)، اضافه میگردید و تا ظهور محلول سفید شیری رنگ ورتکس میشد. سپس به مدت 10 دقیقه در انکوباتور Cº 65 قرار میگرفت.
• CTAB برای جداسازی بقایای سلولی و دناتوره شدن پروتئینها و همچنین برای ترکیب شدن پلیساکاریدها با CTAB در محلول حاوی اسید نوکلئیک استفاده میگردد.
5- یک حجم (در حدود 750 میکرولیتر) ایزوآمیل الکل– کلروفرم (نسبت 1 به 24) به هر میکروتیوب اضافه و حداقل به مدت 10 ثانیه ورتکس شده و در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه در g 12000 سانتریفیوژ میگردید.
ترکیبات یاد شده باعث جداسازی ترکیب CTAB- پروتئین/پلیساکارید میگردد و سه فاز آبی حاوی DNA در بالا، ترکیبات آلی در فاز پائینی و فاز پروتئینی به صورت یک لایه سفید رنگ در حد واسط فاز آبی و فاز پائینی پدید میآورد. به دلیل عوارض بیماریزای فنل، در روشهای جدید استخراج DNA از فنل استفاده نمیشود (ون سولینگن 1996).
6- با دقت و با کمک سمپلر200 به تدریج و به آهستگی فاز آبی را که حاوی DNA بود و در قسمت فوقانی دو فاز دیگر قرار داشت (در هر بار حدود 180 میکرولیتر)، برداشته و به یک میکروتیوب دیگر منتقل میگردید. در حین انتقال ممکن بود مقداری پروتئین به همراه محلول حاوی DNA وارد میکروتیوب شود که برای تخلیص بیشتر DNA مراحل 5 و 6 مجدداً تکرار میشد. نکتهای که از این مرحله به بعد رعایت میگردید این بود که بعلت بزرگ و شکننده بودن DNA ژنومی نمونههای استخراج شده، بعد از لیز سلولها، میکروتیوبها به آرامی تکان داده میشد و هرگز از ورتکس شدید استفاده نمیگردید.
7- به میزان 6/0 حجم (450 میکرولیتر) ایزوپروپانول به فاز آبی حاوی اسید نوکلئیک اضافه و به مدت 30 دقیقه در Cº 20- نگهداری می گردید. در این مرحله بعد از سروته کردن میکروتیوپ کلاف های DNA قابل مشاهده می باشد.
8- میکروتیوبهای حاوی DNA به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق در g 12000 سانتریفیوژ و مایع رویی تا حد امکان دور ریخته میشد و تنها حدود 20 میکرولیتر مایع در انتهای لوله بر روی رسوب باقی میماند.
9- مقدار 1 میلیلیتر اتانول 70% سرد اضافه و میکروتیوبها چند بار سروته میگردید.
10- محلول فوق 5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ و سپس مایع رویی دور ریخته شده و حدود 20 میکرولیتر مایع بالای رسوب باقی میماند.
11- میکروتیوبها به مدت 1 دقیقه مجدداً سانتریفیوژ شده و با استفاده از سمپلر 20 با احتیاط آخرین 20 میکرولیتر بالای رسوب دور ریخته میشد تا اطمینان حاصل شود که تمام اتانول خارج شده است. طی مراحل 7 الی 11 املاح اضافی نیز حذف میگردید.
12- میکروتیوب حاوی رسوب DNA در دمای اتاق قرار میگرفت تا خشک شود.
13- مجدداً
روی رسوب DNA، 20 میکرولیتر بافرTE ریخته می شد تا به خوبی حل گردد.
DNA به دست آمده برای بررسی اولیه توسط الکتروفورز و تخمین میزان DNA در دمای Cº 4 نگهداری میشد و پس از آن در دمای Cº 20- ذخیره میگردید. .
3_4_8_ ارزیابی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده
3_4_8_1_ ارزیابی کیفیت DNA استخراج شده
3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی جهت ارزیابی کیفی DNA استخراج شده
• بافر تریس – بورات – EDTA یک برابر(TBE 1X)
89 میلی مول تریس (p.a)، 89 میلی مول اسید بوریک و 5/2 میلی مول EDTA مخلوط و pH محلول روی 2/8 تنظیم شد.حجم نهایی یک لیتر در نظر گرفته شد و محلول فوق پس از اتوکلاو در حرارت اتاق بمدت یکسال قابل نگهداری است.
• بافر نمونه یا Loading buffer 1X DNA همراه با RNase
یک استوک با محلول بافر نمونه 5X DNA همراه با RNase تهیه گردید. 50 گرم گلیسیرین ، 50 میلی مولار تریس HCl با pH 5/7، 5 میلی مولار EDTA 05/0 گرم بروموفنل بلو ، 300 میکرولیتر از RNase 10 میلیگرم در میلیلیتر به مواد بالا آب مقطر اضافه شد تا حجم نهائی محلول به 100 میلیلیتر برسد. محلول بمدت 15 دقیقه در بن ماری 100 درجه قرار گرفت. برای به دست آوردن غلظت یک برابر (این محلول استوک)، به نسبت 1 به 4 با آب مقطر رقیق شد.
• ژل آگارز
عدم دقت در طول مراحل استخراج DNA ژنومی با توجه به اندازه بزرگ آن میتواند موجب شکستگی DNA گردد و در روی ژل به صورت اسمیر بلندی ظاهر شود.DNA مناسب بر روی ژل به صورت باند واضح و مشخص، کمی پائینتر از چاهک مشاهده میشود. برای مشاهده خلوص و عدم شکستگی در DNA استحصال شده، کیفیت تمام نمونهها با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگارز بررسی میشد.
آگارز از یک نوع جلبک دریائی استخراج میشود و یک پلیمر خطی د- گالاکتوز و 3 و 6- آنهیدروز ال- گالاکتوز است. ژل آگارز به وسیله ذوب آن و سپس ریختن داخل یک قالب و اجازه دادن جهت بستن ژل در دمای اتاق تهیه شد. دانسیته آن بستگی به غلظت آگارز دارد. هنگامیکه یک فیلد الکتریکی در سراسر ژل برقرار میگردد ، DNA که دارای شارژمنفی میباشد در pH خنثی به طرف آند (مثبت) مهاجرت میکند. سرعت مهاجرت به پارامترهای متعددی مانند: سایز مولکولی DNA، غلظت آگارز و شکل و ترکیب DNA بستگی دارد.
در این تحقیق ارزیابی کیفیت DNA با روش الکتروفورز در ژل اگارز، به ترتیب زیر انجام میشد.
1- مقدار 5/0 گرم آگارز با درجه مولکولار بیولوژی وزن و داخل ارلن 250 میلیلیتری منتقل میشد.
2- روی آگارز 50 میلی لیتر TBE ریخته و بر روی حرارت شعله قرار میگرفت تا اگارز کاملاً حل شده و کاملاً شفاف گردد.
3- محلول فوق از روی شعله برداشته و در فضای آزمایشگاه قرار داده میشد تا دمای آن به Cº 60-50 برسد.
4- مقدار 10 میکرولیتر اتیدیوم بروماید رقیق شده (5/0 میکروگرم در میلیلیتر) به محلول آگارز اضافه میشد، بنحوی که رنگ آن پوست پیازی گردد.
5- دو سمت باز سینی مخصوص تانک الکتروفورز (محفظه ژل) با چسب نواری کاغذی به دقت مسدود میشد. لازم به ذکر است که اگر محدود نمودن لبههای سینی تانک توسط چسب با دقت انجام نمیگرفت باعث خروج ژل از محفظه ژل میگردید.
6- آگارز در حرارت Cº 60-50 به آرامی درون محفظه ژل ریخته میشد. اگر دمای ژل آگارز پائین میبود باعث غیر یکنواختی در هنگام بستن ژل میگردید و در این صورت جریان به خوبی از ژل عبور نمینمود و اگر دمای آن بالا بود باعث باز شدن چسبها و نشت آگارز میگردید.
7- قبل از ریختن آگارز در سینی ژل، شانه ژل با تعداد چاهک مناسب در درون سینی ژل قرار گرفت. در هنگام قرار دادن شانه، فاصله مناسب شانه از طرفین و پائین، نسبت به محفظه ژل رعایت میگردید.
8- بعد از بستن ژل، شانه به آرامی و با دقت از درون ژل خارج میشد.( این کار به نحوی صورت می پذیرفت که موجب بریدگی ژل و بهم ریختگی چاهکها، نگردد).
9- نوار چسب انتهای سینی به آرامی کنده میشد تا در هنگام قرار گرفتن در تانک الکترفورز جریان برق به خوبی برقرار گردد.
10- سینی ژل آگارز درون تانک الکترفورز به نحوی قرار داده میشد که جهت چاهک ژل در طرف کاتد (الکترود منفی یا سیاه) تانک الکترفورز قرار میگرفت.
11- درون تانک الکترفورز بافر TBE ریخته میشد. لازم به ذکر است که همیشه غلظت و نوع بافر مورد استفاده در تهیه ژل و تانک الکترفورز یکسان بود.
12- مقدار 25 میکرولیتر از مخلوط DNA و بافر نمونه به آرامی درون چاهکها ژل ریخته میشد (نسبت DNA به بافر نمونه 1 به 5 میباشد).
13- درب تانک الکترفورزگذاشته وتانک الکترفورزبه منبع الکتریکی متصل ودستگاه باولتاژ 80 روشن شد.
14- بعد از گذشت زمان کافی (تقریباً 5/0-1 ساعت) که رنگ بروموفنل بلو نزدیک به انتهای ژل میرسید، دستگاه الکترفورز خاموش میشد.
15- ژل به آرامی از محفظه ژل (سینی تانک الکترفورز) جدا و بر روی دستگاه ترانس لومیناتور قرار داده و DNA از نظر میزان و کیفیت، بررسی میشد.
16- در صورت مناسب بودن کیفیت DNA از ژل عکس برداری و مشخصات آن در کامپیوتر ثبت و ذخیره میشد. میتوان از سایز مارکر مناسب جهت تخمین میزان DNA استفاده نمود و با توجه به الگوی نمونههای استاندارد DNA مایکوباکتریوم، غلظت تقریبی DNA را تخمین زد. در این تحقیق به دلیل موجود بودن دستگاه نانودراپ و تعیین بسیار دقیق غلظت DNA از تخمین آن به این روش صرف نظر گردید.
3_4_8_2_ ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP
تخمین غلظت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ
دستگاه نانودراپ متشکل از یک بدنه و دو بازو می باشد. یکی از بازوها روی بدنه آن ثابت بوده و دیگری حول محوری حدود 90 درجه قابلیت جابجائ
ی و حرکت دارد که به وسیله فیبر نوری به بدنه متصل است و ضمناً روی هر کدام از بازوهای دستگاه محلی جهت قرار گرفتن مایع، برای اندازه گیری قرار دارد. این دستگاه بر اساس سنجش طول موج به دست آمده از نمونه مورد ارزیابی کار میکند (تصویر 3-7).

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منبع مقاله دربارهof، and، al، the

تصویر3-7: دستگاه نانودراپ
مراحل تعیین کمیت DNA با استفاده از این دستگاه به صورت زیر انجام میپذیرفت.
1- دستگاه کامپیوتر و نانودراپ روشن میگردید و گزینه ND-1000-V3, 2, 1 انتخاب و برنامه اسید نوکلئیک اجرا میشد (تصویر 3- 8).

تصویر

دسته‌ها: پایان نامه ها

دیدگاهتان را بنویسید