(EDC-NHS) به GO متصل شده (شکل 1-22) و حلالیت و پایداری بی‌نظیری را در آب و محیط رشد سلولی نشان داده است. طی آزمایشات متعدد در آزمایشگاه حد آشکارسازی ngmL–1 25/7 nM)4/0 (~ برای کاسپاز3 بدست آمده است. نانو هیبرید گرافن‌اکسید- پپتید به طور موثری به درون سلول‌های HeLa (سلول‌های سرطانی دهانه رحم) هدایت شده و فعالسازی کاسپاز3 که به وسیله‌ی staurosporine (STS) تحریک شده بود، توسط نانوحسگر پروتئاز درون سلولی شناسایی شده است (شکل 1-23) [44].
شکل1-22 روش تثبیت پپتید بر سطح GO
شکل1-23 شناسایی کاسپاز3 با استفاده از نانوهیبرید گرافن اکسید- پپتید
توسعه‌ی حسگرهای زیستی جدید با حساسیت، گزینش‌پذیری و سرعت بالا در شناسایی عوامل بیماری‌زا، تشخیص‌های پزشکی، غربالگری ایمنی و در جلوگیری از آلودگی محیط زیست از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است.GO به علت داشتن خواص منحصر به فردی مانند تغییر سطح آسان، استحکام بالا، قابلیت دیسپرس شدن خوب در آب و فوتولومینسانس، پتانسیل بالایی برای استفاده در حسگرهای زیستی دارد.
در سال‌های اخیر جانگ49 و همکارانش یک حسگر زیستی بر پایه‌ی GO برای شناسایی روتاویروس به عنوان یک عامل بیماری‌زا گزارش کردند. که در آن GO بر سطح شیشه‌ای اصلاح شده‌ی آمینی رسوب داده شده و آنتی‌بادی روتاویروس از طریق واکنش تشکیل آمید به کمک کربو‌دی‌ایمید، بر سطح GO تثبیت شده است. سپس آنتی‌بادی دوم روتاویروس به وسیله‌ی یک مولکول DNA به عنوان واسطه به نانو ذره‌ی طلا متصل شده است. نحوه‌ی اتصال آنتی‌بادی روتاویروس به نانو ذره‌ی طلا در شکل 1-24 آورده شده است.
شکل1-24 نحوه‌ی تشکیل کمپلکس Ab-DNA-AuNP
زمانی که سلول روتاویروس موجود در نمونه‌ی مورد نظر با برهمکنش ویژه‌ی آنتی‌بادی-آنتی‌ژن به آنتی‌بادی موجود در سطح GO متصل شده است، اتصال سلول هدف با مشاهده‌ی کاهش فلورسانس GO از طریق FERT50 بین GO و نانو ذره‌ی طلای متصل به آنتی‌بادی دوم تایید شده است. به این ترتیب شناسایی عامل بیماری‌زا به وسیله‌ی حسگر زیستی امکان‌پذیر شده است. شکل1-25 این حسگر زیستی را نشان می‌دهد. قابل ذکر است که حدآشکارسازی حسگر زیستی برای روتاویروس pfumL-1105 بوده است [45].
شکل1-25 حسگر زیستی بر پایه‌ی GO.
زو51 و همکارانش اخیراً پروب‌های حاوی رنگ‌های فلورسنت بر پایه‌ی GO را برای شناسایی توالی‌های خاصی از DNA گزارش کردند. آن‌ها سه توالی نوکلوتیدی مربوط به ویروس‌های ایدز52 (HIV)، آبله53 (VV) و ابولا54 (EV) را به ترتیب با استفاده از رنگ‌های آلی Alex Fluor 488، ROX و Cy5 شناسایی کردند که طرح کلی این روش شناسایی حساس چند DNA در شکل 1-26 آورده شده است.
شکل1-26 نحوه‌ی شناسایی چند DNA هدف
در مرحله‌ی اول پروب‌های تک رشته‌ای DNA دارای رنگ‌های آلی بر روی GO جذب سطحی شده، و در مرحله‌ی بعد با افزودن DNA مکمل هر کدام از پروب‌ها (DNAهای هدف (T1, T2, T3، پروب‌ها با DNAهای هدف هیبرید شده و از سطح GO جدا شده‌اند. مرحله‌ی اول با کاهش شدید شدت فلوئورسانس و مرحله‌ی دوم با افزایش شدت فلوئورسانس رنگ‌های آلی همراه بوده است (شکل 1-27).
شکل1-27 طیف فلوئورسانس اسکن همزمان
تحت شرایط بهینه رابطه‌ی بین شدت فلوئورسانس رنگ‌های آلی Alex Fluor 488، ROX و Cy5 و غلظت DNAهای هدف در بافر Tris-HCl بررسی شده است. شکل 1-28 طیف فلوئورسانس اسکن همزمان در حضور غلظت‌های مختلف DNAهای هدف (قسمت a شکل) و نیز رابطه‌ی خطی بین شدت فلوئورسانس رنگ‌های آلی(∆I) و غلظت DNAهای هدف (C) (قسمت‌های b تاd شکل) را نشان می‌دهد که در آن I1∆، I2∆ و I3∆ به ترتیب بیانگر شدت فلوئورسانس رنگ‌های آلی Alex Fluor 488، ROX و Cy5و نیز C1، C2 و C3 به ترتیب بیانگر غلظت DNA ویروس‌های ایدز، آبله و ابولا هستند. همچنین حد آشکارسازی این روش برای ویروس‌های ایدز، آبله و ابولا به ترتیب pM 36، pM 37 و pM 250 بدست آمده است [46].
شکل1-28 a. طیف فلوئورسانس اسکن همزمان در حضور غلظت‌های مختلف DNAهای هدف، منحنی‌های کالیبراسیون برای تعیین کمی غلظت DNA ویروس‌های b. ایدز c. آبله d. ابولا
لو55 و همکارانش با استفاده از GO، مولکول‌های زیستی DNA و پروتئین را با حساسیت و گزینش‌پذیری بالا شناسایی کردند. برای این منظور آن‌ها از پروب DNA مرتبط با ویروس ایدز و آپتامر56 ترومبین57 انسانی استفاده کردند که هر یک با رنگ فلوئورسنت FAM نشاندار شده بود. روند کلی شناسایی در شکل 1-29 نشان داده شده است.
شکل1-29 نحوه‌ی شناسایی DNA با استفاده از GO
پروب DNA تک رشته‌ای نشاندار شده با FAM (P1) از طریق برهمکنش‌های غیرکووالانسی به صفحات GO متصل شده، که با کاهش شدت فلوئورسانس FAMهمراه بوده است (مرحله‌ی a شکل 1-29). سپس با اضافه شدن DNA هدف (HIV1)، P1 با آن هیبرید شده و DNA دو رشته‌ای حاصل، از سطح GO جدا شده است، که این فرآیند سبب افزایش شدت فلوئورسانس FAM شده است (مرحله‌ی b شکل 1-29).
در شکل 1-30 طیف نشری فلوئورسانس P1 در شرایط مختلف آورده شده است که این طیف در غیاب GO، به علت حضور FAM نشر فلوئورسانس بالایی را نشان می‌دهد (پیک a). اما در حضور GO به علت جذب سطحی P1 بر روی آن، تا حدود %97 کاهش نشر فلوئورسانس مشاهده می‌شود (پیک c). همچنین کمپلکس P1-GO به محض اضافه شدن HIV1، افزایش نشر فلوئورسانس قابل توجهی را نشان می‌دهد (پیک d).
شکل1-30 طیف نشری فلوئورسانس P1 در شرایط مختلف P1 (aدر حضور بافر Tris-HCl
(b (c P1+HIV1 P1+GO و (d P1+GO+HIV1
شناسایی پروتئین‌ها نیز طی روند نشان داده شده در شکل 1-29 صورت گرفته است، که در آن جذب سطحی آپتامر نشاندار شده با FAM بر روی صفحات GO سبب کاهش شدید نشر فلوئورسانس (تا حدود %96) شده، و همچنین متصل شدن ترومبین (به عنوان مولکول هدف) به آپتامر، سبب جدا شدن آن از سطح GO و افزایش نشر فلوئورسانس شده است.
شکل 1-31 طیف نشری فلوئورسانس آپتامر نشاندار شده با FAM را در حضور GO و غلظت‌های مختلف ترومبین انسانی نشان می‌دهد که با افزایش غلظت ترومبین، شدت نشر فلوئورسانس نیز افزایش می‌یابد. قابل ذکر است که آپتامرها در اتصال به پروتئین‌ها کاملا اختصاصی عمل می‌کنند. و حد تشخیص روش مذکور برای ترومبین انسانی حدود nM 2 بدست آمده است. بنابراین این روش از حساسیت و گزینش‌پذیری بالایی برخوردار بوده است [47].
شکل1-31 طیف نشری فلوئورسانس آپتامر- GO در حضور غلظت‌های مختلف ترومبین
1-7- هدف از کار پزوهشی حاضر
سرطان ریه یکی از مهم‌ترین و شایع‌ترین انواع سرطان در سراسر دنیا می‌باشد. بیش از %80 موارد آن در مراحل پیشرفته‌ی بیماری تشخیص داده می‌شوند. از آنجایی که تشخیص این نوع سرطان در مراحل اولیه، در درمان بیماری بسیار مفید می‌باشد، لذا تشخیص زودهنگام آن از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. هدف از کار پژوهشی حاضر ساخت نانوحسگر زیستی بر پایه‌ی نانوهیبرید گرافن اکسید–DNA برای شناسایی سرطان ریه می‌باشد. که طی آن جهش‌های حذفی موجود در سلول‌های سرطانی شناسایی می‌شود. از مزایای روش ارائه شده، می‌توان به سرعت بالا، ساده و ارزان بودن آن و امکان شناسایی بیماری در مراحل اولیه اشاره کرد.
فصل دوم: بخش تجربی