همکارانش به بررسی و آماده سازی نانو ذرات کیتوسان به عنوان حامل برای تثبیت آنزیم پروتئاز خنثی پرداختند. این تحقیق نشان داد که pH محلول و وزن مولکولی کیتوسان، غلظت کیتوسان ، غلظت سدیم تری پلی فسفات66 (TPP) به میزان قابل توجهی با اندازه نانو ذرات در ارتباط است ]82[.
تانگ و همکاران در سال 2007 لیپاز خالص تجاری را بر روی نانو ذرات کیتوسان که با روش ژل شدن یونی67 تهیه شده بود تثبیت کردند سپس ویژگی های آنزیم تثبیت شده و ثوابت سینتیکی آن را تعیین نمودند. آنها نشان دادند که تثبیت لیپاز بر روی نانو ذرات کیتوسان فعالیت آنزیم را بیشتر از لیپاز خنثی و آزاد بهبود می بخشد و نتایج آنها با مقایسه ثابت میکائیلیس نشان دهنده آن است که آنزیم تثبیت شده میل ترکیبی بیشتری به سوبسترا دارد آنها پس از بررسی به این نتیجه رسیدند که pH بهینه برای یک آنزیم تثبیت شده 5/7 بوده و دمای مطلوب °C45 است. ماندگاری و پایداری دمایی و عملکرد و ذخیره سازی یک آنزیم بعد از تثبیت بر روی نانو ذرات کیتوسان توسعه و بهبود یافت. ذرات نانوی کیتوسان برای حفاظت از فعالیت لیپاز خنثی و آزاد به کار میرود. آن ها فعالیت آنزیم لیپاز خنثی تثبیت شده را 17/13% بیش از لیپاز خنثی آزاد یافتند ]83[.
در سال 2007 دوستگانی و همکاران مطابق روش آماری تاگوچی طی آزمایشاتی شرایط بهینه برای تهیه نانو ذرات از پلیمر طبیعی کیتوسان تعیین کردند. نتایج به دست آمده نشان داد که غلظت کیتوسان بیشترین و وزن مولکولی آن کمترین اثر را بر اندازه نانو ذرات تهیه شده از کیتوسان دارد ]5[.
در سال 2007 تانگ و همکارانش با تحقیقی بر لیپاز های خنثی به دست آمده از محلولهای آبی در نانو ذرات کیتوسان به این نتیجه رسیدند کیتوسان میتواند حامل بسیار خوبی برای عملکرد صحیح لیپاز باشد]86[.
در سال 2007 تانگ و همکارانش پروتئیناز خنثی و نوکلئاز را بر روی نانو ذرات کیتوسان تثبیت نموده و شرایط مناسب مربوط به تثبیت آنها یک میلیگرم از پروتئیناز خنثی بر روی نانو فیبر کیتوسان به مدت 15 دقیقه در دمای 40 درجه سانتیگراد غیر فعال شد و در شرایط مناسب آزمایشگاهی فعالیت آنزیم با بازده 3/84% همراه بودند. و آنزیم خواص دیگری را نشان میداد مثل ثبات گرمایی، استفاده مجدد و ثبات ذخیره سازی پس از غیر فعال شدن روی نانو فیبر کیتوسان]82[.
بیرو و همکارانش در سال 2008، ذرات ماکرو، میکرو و نانویی کیتوسان را آماده کردند که به عنوان حاملهای تثبیت به روشهای رسوبگذاری، پیوند امولسیونی و روش ژلاتین یونی بهکار رفتند. بالاترین میزان فعالیت توسط بیوکاتالیزور غیرفعال شده بر روی نانو ذرات نشان داده شد ]85[.
serra در سال 2008 آزمایش نمود که اندازه ذرات متخلخل اختصاصا SAB-15 بر روی کارایی تثبیت مهم است. فعالیت لیپاز تثبیت شده بر روی SAB-15 در واکنش هیدرولیز تری استات گلیسرول به مراتب بیش از بستر های جاذب دیگر میباشد]80[.
Wue و همکاران در سال 2009 نشان دادند که فعالیت لیپاز تثبیت شده با افزایش مقدار لیپاز کاهش مییابد. میتوان گفت هرگاه لیپاز بیشتر به حفره حفاظ منتشر میشود مقداری از آن جمع میشود و به صورت یک لایه در سطح داخلی کانال توزیع نمیشود. و به کاهش فعالیت آنزیم در نتیجه تماس با سوبسترا میانجامد. فعالیت لیپاز آزاد نیز چند بار با استفاده از روش مشابه اندازهگیری شد حدود 5×104 U کمتر از لیپاز تثبیت شده روی SAB-15 است و با مقدار لیپاز افزوده شده تغییر نکرد]81[.
در سال 2010 گائو و همکارانش به تحقیقی بر روی قطر نفوذ و روش اتصال عرضی بر تثبیت آنزیم لیپاز از گونه Candida rugosa در میان مواد متخلخل پرداختند و از کیتوسان و گلوتارآلدئید به عنوان پل وعامل اتصال عرضی استفاده کردند و در نتیجه دریافتند که فعالیت لیپاز جذب شده با منشأ کاندیدا بیشتر از فعالیت لیپاز در حالت آزاد است ]81[.
در صنایع فرآوری مواد غذایی و بیوتکنولوژی تثبیت سازی آنزیم نقش بسیار مهمی بر عهده دارد. همان طور که در فصل های پیش بیان شد کیتوسان، یک پلی ساکارید طبیعی است که با N-دی استیلی شدن کتین تولید میشود. و از آن در صنایع غذایی و بیوتکنولوژی استفاده میشود. در سال 2011، لی ژائو و همکارانش به بررسی و آماده سازی نانو ذرات کیتوسان و نانو فیبر واستفاده از آنها در کپسولی کردن و غیر فعال کردن ترکیبات بیو اکتیو پرداختند. از بررسی های به دست آمده میتوان نتیجه گرفت که نانو ذرات کیتوسان به دلیل داشتن خواص بیولوژیکی خاصی مثل غیر سمی بودن، سازگاری با محیط زیست، توانای آنتی باکتریایی ، برای حمل دارو و تقویت تکثیر سلولی، دارای پتانسیلی مطلوب است ]84[.
فصل سوم
مواد و روش ها
3-1- مقدمه:
در این مطالعه بر اساس واکنش اتصال کووالان باز شیف68 آنزیم لیپاز برروی نانو ذره کیتوسان با استفاده از گلوتارآلدئید تثبیت شد و سپس فعالیت لیپاز در دو حالت آزاد و تثبیت شده بر اساس دو روش 1-کیت تشخیصی پارس آزمون و 2-سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) بررسی و مقایسه شد. همچنین اثر تغییرات دما و pH بر فعالیت آنزیم لیپاز در دو حالت آزاد و تثبیت شده بررسی شد .با استفاده از میکروسکوپ الکترونی SEM خصوصیات نانو ذرات سنتز شده تعیین شد و به کمک دستگاه زتا سایزر(ZETA SIZER) توزیع اندازه نانو ذرات کیتوسان قبل و بعد از تثبیت لیپاز نشان داده شد. همچنین با استفاده از طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) ، طیف آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده مورد مطالعه قرار گرفت.
3-2-مواد شیمیایی:
اسید استیک 1% ، پودر کیتوسان با وزن مولکولی متوسط و پودرآنزیم لیپاز سودموناس از شرکت سیگما آمریکا، گلوتار آلدئید با درجه خلوص 25%، سدیم دو دسیل فسفات (SDS)، تریتون X100 ، پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) ، بافر فسفات، بافر تریس، و اسید استیک از شرکت مرک آلمان ، کیت سنجش لیپاز شرکت پارس آزمون.
-اسید استیک 1%:
از مخلوط نمودن cc 1 اسید استیک در cc 99 آب مقطر، اسید استیک %1 به دست میآید.
-گلوتار آلدئید:
از گلوتارآلدئید با درصد خلوص 25 و دانسیته gr/ml1 استفاده شد.
شکل 3-1- فرمول شیمیایی گلوتارآلدئید
شکل 3-2- فرم فضایی گلوتارآلدئید
-پودر کیتوسان:
در این تحقیق از محلول به دست آمده از پودر کیتوسان استفاده گردید. برای آماده سازی محلول کیتوسان، ابتدا gr 1/0 پودر کیتوسان با وزن مولکولی متوسط، در cc100 اسید استیک 1% حل گردید، سپس 9میلی لیتر اسید استیک 1% را با 1میلی لیتر محلول کیتوسان مخلوط کرده و در دستگاه سنیکیتور به مدت 30 دقیقه با دور بالا (rpm 1000 )قرار داده شد و بدین ترتیب محلول کیتوسان آماده گردید.
-آنزیم لیپاز:
به صورت پودر از گونه باکتریایی Psedomonase Cepacia از شرکت سیگما آلدریچ تهیه شد. برای استفاده از لیپاز این آنزیم به صورت محلول تهیه گردید.
-تهیه محلول آنزیم لیپاز: برای تهیه این محلول 1 میلی گرم از پودر لیپاز در ml1 بافر فسفات با pH 4/7 حل شد .
-بافر فسفات:
برای تهیه بافر فسفات ابتدا 9/13 گرم، Na2H2PO4 را در CC500 آب مقطر حل و سپس 825/26گرم ، Na2HPO4 را در CC500 آب مقطر حل کرده تا محلول 2/0 مولار هر یک از نمک های فسفات بدست آید. سپس CC19 از محلول اول با CC81 از محلول دوم مخلوط شد و با افزودن ml100 آب مقطر به آن، بافر فسفات 0.1 مولار با pH 4/7 تهیه شد.
3-3-وسائل و دستگاه های مورد نیاز:
3-3-1-ظروف آزمایشگاهی:
ارلن ، بشر، بالن ژوژه در حجم های مختلف ، فیلتر، سرنگ، ویال اپندروف درب دار، انواع سمپلر های حجمی، پیپت، پوآر، لوله آزمایش.
3-3-2-دستگاه ها:
سانتریفیوژ، سنیکیتور، اسپکتروفتومتر، استیرر، شیکر لوله، pH متر، ترازوی دیجیتال، حمام آب، میکروسکوپ الکترونی روبشی، زتاسایزر.
-سانتریفیوژ : از سانتریفیوژ یخچال دار مدل Universal 32R با دور 12000 استفاده شد.
شکل 3-3- سانتریفیوژ مورد استفاده در این تحقیق
-سنیکیتور: در آزمایشات از دستگاه سنیکیتور با مدل HD 2070 ساخت کشورآلمان از کمپانی BANDELIN و Cycle 5/0 استفاده گردید.
شکل 3-4- سنیکیتور مورد استفاده در این تحقیق
-اسپکتروفتومتر: این دستگاه به منظور تعیین میزان فعالیت آنزیم لیپاز به روش رنگ سنجی مورد استفاده قرار گرفت. اسپکتروفتومتر مورد استفاده در این تحقیق ساخت شرکت UNICO در کشور آمریکا و مدل 2100 SERIES بود.
شکل 3-5- اسپکتروفتومتر مورد استفاده در این تحقیق
-استیرر: از استیرر با دور 1000 rpm استفاده گردید.
شکل 3-6- استیرر مورد استفاده در این تحقیق
-شیکر لوله: به منظور مخلوط و هموژن کردن ترکیبات شیمیایی و محلول های آنزیمی در لوله ها و میکروتیوب ها از شیکر لوله استفاده شد.
شکل 3-7- شیکرلوله مورد استفاده در این تحقیق
-pH متر: از pH متر قابل حمل به منظور تعیین pH محلول در قبل و بعد و حین انجام واکنش ها استفاده شده است. pH متر مورد استفاده ساخت شرکت آلمانی Metrohm با دقت 01/0 بود.
شکل 3-8-pH متر مورد استفاده در این تحقیق
ترازوی دیجیتال: برای اندازه گیری های مختلف از ترازو با دقت 001/0 گرم ساخت شرکت AND آلمان استفاده گردید.
شکل 3-9- ترازوی دیجیتال مورد استفاده در این تحقیق
-حمام آبی:
از حمام آبی ساخت شرکت ایرانی فن آزما گستر مدل WM 22 برای انکوباسیون دمایی محلول آنزیمی استفاده شد.
شکل 3-10- حمام آبی مورد استفاده در این تحقیق
3-4-روش های آزمایشگاهی بکار گرفته شده در پایان نامه:
3-4-1-سنتز نانو ذرات کیتوسان:
ابتدا محلول کیتوسان (gr1/0 از پودر کیتوسان با وزن مولکولی متوسط در ml100 اسید استیک 1% ) را درون ارلن ریخته به همراه یک عدد مگنت به مدت 30 دقیقه بر روی استیرر قرار داده تا محلول شفاف به دست آید. سپس به مدت 20 دقیقه سنیکیت نموده و سپس با pH متر،pH را اندازه گرفته با باز NaOH ، pH
به 5/5-6 رسانده شد. زیرا در این pH محلول پایدارتری خواهیم داشت. دوباره به مدت 20 دقیقه سنیکیت نموده و بعد 10 میکرولیتر گلوتارآلدئید اضافه نموده به مدت 12-24 ساعت روی استیرر گذاشته سپس محلول با سرنگ از فیلتر 2/0 عبور داده شد. فاز زیرین را جمع آوری گردید.
3-4-2-تثبیت آنزیم لیپاز به روش اتصال کووالان بر اساس واکنش باز شیف:
برای تثبیت آنزیم لیپاز از واکنش باز شیف استفاده شد. که همان طور که از واکنش 3-1 مشخص است این واکنش یک واکنش تراکمی گروه آلدئیدی (-CHO) با گروه آمینی مولکول دیگر و تشکیل پیوند دوگانه HC=N-R و تولید یک مولکول آب است.
واکنش 3-1-مکانیسم لیپاز و اتصال عرضی گلوتارآلدئید
واکنش 3-2- بازشیف
در این تحقیق آنزیم لیپاز را به روش اتصال کووالان تثبیت شد. ابتدا درون یک بشرکوچک بافر فسفات و سپس ml1 محلول لیپاز سودوموناسmg/l1 اضافه گردید و سپس ml 5/5 محلول نانوکیتوسان گلوتارآلدئید به تدریج در مدت یک دقیقه اضافه کرده، مواد داخل بشر به همراه یک عدد مگنت، درون بشر بزرگتری که حاوی یخ فراوان است برروی استیرر که با دور rpm 1000 روشن است، قرار داده شد. بعد از مدت 2 ساعت که عملیات تثبیت از طریق Cross Link با گلوتارآلدئید انجام شد محلول حاصل که دو فاز است را در ویال ریخته و در دستگاه سانتریفوژ یخچال دار، با سرعت rpm 10000 در دمای °C4 سانتریفیوژ نموده و در سه مرحله با بافر فسفات شستشو داده شد.
3-4-3-تعیین خصوصیات نانوذره کیتوسان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی:
میکروسکوپ الکترونی روبشی:
در این تحقیق به منظور تائید سنتز نانو ذره کیتوسان و تعین خصوصیات آن مشخصات شکلشناسی و اندازه نانو ذرات کیتوسان از میکروسکوپ نوری نوع اول،

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید