منابع پایان نامه ارشد درباره آنزیم، لیپاز، فعالیت

حالت واسطه تفاضل سرعت واکنشهای تولید و مصرف این ماده میباشد:
1-4
ثابت میماند :
1-5
غلظت کل آنزیم برابر مجموع غلظتهای آنزیم آزاد و آنزیم متصل به سوبسترا میباشد:
1-6
با ترکیب روابط (1-4) و (1-6) عبارت زیر به دست میآید:
1-7
ثابت میکائیلیس (KM) ، به صورت زیر تعریف میشود:
1-8
در منحنی اشباع آنزیمی، Vm از نقاط سرعت های بهدست آمده در غلظت های بالای سوبسترا حاصل میشود. این نقاط در امتداد یک خط افقی قرار گرفته اند که محور V را در محل V=Vm قطع میکند.حال اگر نصف مقدار فوق یا 1/2Vm روی محور مشخص شده و از آن خطی به موازات محور V رسم گردد، محل تقاطع خط با منحنی معرف مقدار سوبسترایی است که مقدار عددی آن مساوی Km میباشد. به عبارتی میتوان گفت Km معادل مقدار سوبسترایی است که نصف سرعت ماکزیمم را ایجاد نماید. این ارتباط از طریق معادله میکائیلیس- منتن نیز حاصل میشود. زیرا چنانچه به جای S در معادله، Km جایگزین شود مقدار V=1/2Vm به دست میآید.
شکل 1-7- منحنی اشباع آنزیمی
با ترکیب روابط (1-7) و (1-8) عبارت زیر به دست میآید:
1-9
با حل معادله (1-9) برای حالت واسطه، نتیجه میشود:
1-10
با ترکیب رابطه (1-3) و (1-9) عبارت زیر به دست میآید:
1-11
حد اکثر سرعت واکنش (VMax) در غلظت های بالا از سوبسترا و زمانی که آنزیم اشباع شده است، اتفاق میافتد:
1-12
با ترکیب روابط (1-11) و (1-12) عبارت زیر به دست میآید که به معادله میکائیلیس- منتن موسوم است:
1-13
1-5-7- معادله لینویور- برک15:
به دست آوردن پارامتر های آنزیمی Vmو Kmاز طریق منحنی میکائیلیس- منتن دقت کافی ندارد زیرا در این منحنیها نقاط تجربی بهدست آمده در غلظتهای افزایشی سوبسترا در امتداد یک خط مستقیم قرار نمیگیرند و عموما تعیین Vm از طریق منحنی با اشتباهاتی همراه است. برای رفع این خطا میتوان معادله را به نحوی مرتب کرد که به شکل معادله خطی در آید و پارامترهای Km و Vm را از تقاطع خطوط با محورهای X و Y به دستآورد. این معادله که شکل خطی معادله میکائیلیس- منتن است به معادله لینویور- برک موسوم است.
جهت تعیین مقادیر پارامترهای معادله (1-13) ، با معکوسگیری از این رابطه نتیجه میشود که به معادله لینویور- برک میرسیم:
1-14
اگر منحنی بر حسب رسم شود، شیب خط حاصل و عرض از مبدأ آن به دست میآیند. منحنی حاصل Lineweaver-Burk plot نام دارد.
شکل 1-8- نمودار لینویور برک
1-5-8- آنزیم لیپاز:
آنزیمی که در طبیعت برای هیدرولیز کردن چربی ها و روغن ها تخصیص داده شده است، لیپاز نام دارد. این ساده ترین فرایندی است که لیپاز در آن شرکت میکند [27]. در شکل 1-9 تصویر سه بعدی از ساختار لیپاز نشان داده شده است.
لیپاز در محیط های آبی محلول است ولی با سوبسترای محلول در آب فعالیت نشان نمیدهد و یا فعالیت کمی دارد. این آنزیم در محیط های قطبی و غیرقطبی پایدار است [28].
لیپازها یا )هیدرولیز کنندههای استرهای گلیسرول EC 3.1.1.3) آنزیمهایی هستند که هیدرولیز برگشت پذیر منو، دی، تریگلیسیرید (اجزا اصلی تشکیل دهنده چربیها و روغنهای گیاهی و حیوانی و میکروبی) ترکیبات مختلفی که دارای نیمههای استرکربوکسیلی بوده و آسیل گلیسرول نمیباشد را کاتالیز میکنند [29].
شکل 1-9-ساختار سه بعدی آنزیم لیپاز
تحت شرایط معینی مثلا در حضور مقادیر خیلی کم آب لیپازها قادر به کاتالیزکردن واکنش معکوس، استریفیکاسیون وترانس استریفیکاسیون میباشند، تعادل بین واکنشهای هیدرولیز و سنتز به وسیله فعالیت آب مخلوط واکنش کنترل میشود. لیپازها هم چنین قادر به کاتالیز کردن واکنشهای ترانس استریفیکاسیون، اسیدلیز16 ، اینتراستریفیکاسیون17، الکلیز18،‌ آمینولیز19، اکسیمولیز20و تیوترانساستریفیکاسیون21 در حلال غیرآبی (آلی)، سیستمهای دوفازی، محلولهای میسلی با خصوصیت کایرال میباشند.
واکنشهای مختلف کاتالیز شده توسط لیپاز در محلول های آلی و آبی در زیرآمده است [30]:
واکنش هیدرولیز
واکنش سنتز استر
واکنش اسیدی شدن
واکنش اینتراستریفیکاسیون
واکنش الکلی شدن
واکنش آمینی شدن
لیپازها آنزیمهایی با چندین کاربرد هستند، زیرا قادرند فعالیتی شبیه فعالیت آنزیمهای دیگر مثل فسفولیپاز، کلسترول استرئاز، کوتیناز، آمیداز ودِیگر استرئازها را نشان دهند [31].
لیپازها تقریبا به وسیلهی هر موجود زندهای (پستانداران، گیاهان، قارچها، باکتریها، مخمرها) تولید میشوند. علیرغم تفاوت دراندازه (جرمهای مولکولی متفاوت در محدوده 20 تا 60 کیلو دالتون دارند) توالی اسیدآمینه، نوع سوبسترا، فعال کنندهها، بازدارندهها وخواص دیگر اغلب آنها ساختار سه بعدی یکسانی را دارند.
1-5-8-1-کاربرد لیپاز:
کاربرد لیپاز در تغییر و اصلاح چربیها و روغنها نسبت به کاتالیزورهای شیمیائی کلاسیکی مزیت دارد. آنها قادرند تحت شرایط ملایم تری از واکنش ( فشار و دما متوسط ) عمل کنند. در دهههای اخیر علاقه به تولید لیپاز میکروبی افزایش یافته است. این آنزیمها به دلیل تطابق ساختار مولکولی و خواص کاتالیستیشان دارای کاربردهای بلقوهای در بخشهای مختلف صنعتی از قبیل صنایع غذایی، تصفیه فاضلاب، منسوجات، لوازم آرایشی، مواد افزودنی، مواد شیمیایی روغنی، داروسازی، پزشکی، شویندهها، چرم سازی و کاغذ سازی و سوخت که از لیپاز به عنوان کاتالیست به منظور سنتز استرها و همچنین ترنس استریفیکاسون روغن برای تولید بیودیزل بهره میگیرند، میباشد. همچنین لیپازها میتوانند در سنتز پپتید، تولید بیوسورفاکتانت و تجزیه مخلوطهای راسمیک مورد استفاده قرار گیرند. علاوهبر اینها یکی ازکاربرهای محتمل لیپاز تجزیه زیستی پلاستیکهایی مانند پلی هیدروکسی آلکانوات (PHA) و پلی کاپرولاکتان (PCL) میباشد ]32-36[.
و همچنین در صنعت چرم سازی ، لیپاز به همراه پروتئاز برای زدودن چربی های باقی مانده روی پوست حیوانات به کار می رود. همچنین مواد قیر مانند یا ترکیبات هیدروفوبی چرب، مشکلات شدیدی را در کارخانه کاغذسازی ایجاد میکنند. لیپازها برای حذف این مواد از خمیر کاغذ برای تولید بهینه کاغذ مورد استفاده قرار میگیرند ]37[.
جدول 1-1- نمونههایی از کاربردهای صنعتی لیپاز]30[:
محصولها
کاربرد ها
زمینه صنعتی
عوامل معطر برای محصولات لبنی
اسیدهایچرب،دیگلیسیریدها و مونوگلیسیدیدها
واکنشگرهایی برای آنالیز لیپیدها
هیدرولیز چربی شیر
هیدرولیز چربیها و روغنها
هیدرولیز
صنایع غذایی (لبنیات)
صنایع شیمیایی (فرآوری روغن)
شویندههایی برای مصارف خانگی
کیت های تشخیصی
آنالیز توزیع اسید چرب در تری گلیسیریدها
حذف لکه های چربی و روغن
آزمایش تریگلیسیرید خون
صنایع شیمیایی (شوینده)
پزشکی
واسطههای کایرال
استرها، امولسیون کنندهها
سنتز استرها
استریفیکاسیون
صنایع شیمیایی (مواد شیمیایی خالص)
روغنها ویا چربیها
ترنس استریفیکاسیون روغن های طبیعی
صنایع غذایی (شیمیایی و دارویی و کشاورزی)
1-5-8-2- سینتیک واکنش لیپاز:
‌در این نظریه فرض بر این است که آنزیم (E) ابتدا با سوبسترای (S) ترکیب شده،‌ یک مجموعه آنزیم سوبسترا یعنی (ES) به وجود میآورد. این مجموعه بعداً در مرحله دوم شکسته و آنزیم آزاد میشود و فراورده (P) بدست میآید.
1-15- واکنش آنزیمی
این واکنش زمانی معتبر است که آنزیم و سوبسترا هر دو در یک فاز باشند. بنابراین این مدل برای مطالعه آنزیم لیپاز که عمدتاً درسطح مشترک فاز آبی و لیپیدی عمل میکند نمیتواند استفاده شود. اساساً مکانیسم واکنشهای شیمیائی انجام شده درسطوح مشترک یک محیط غیریکنواخت شدیداً به ساختمان سطح مشترک،‌ کئوردیناسیون فضائی و اندرکنشهای فیزیکی بین مولکولهای واکنشگر وابسته میباشند. واکنش شیمیائی انجام شده در سطح مشترک بوسیله فرایندهای جذب22 و واجذبی23، همرفت24 و انتشار مولکولی25 مولکولهای واکنشدهنده و محصولات واکنش تحت تأثیر قرار میگیرد، یکی از این فرآیندها و یا ترکیبی از آنها میتواند تعیینکننده سرعت واکنش باشد]38 [.
مدلهای گوناگونی با اقتباس از مدل سینتیکی میکائلیس منتن برای تطبیق دادن با لیپولیز در سطح مشترک پیشنهاد شد، ‌در ساده ترین مدل ارائه شده توسط ورگر26 و همکارانش در سال 1973 و تکمیل شده آن در سال 1976 حل شدن آنی محصولات واکنش و تشکیل کمپلکس آنزیم – سوبسترا در سطح مشترک فرض میشود ]39 [.
1-16- واکنش کمپلکس آنزیم و سوبسترا
این مدل شامل دو مرحله تعادلی متوالی است. در مرحله اول آنزیم در سطح مشترک به طور برگشت پذیر جذب فیزیکی میشود. پیامد ظاهری این مرحله تغییر ابعادی غلظت، ES* , E* و S* از مول بر متر مکعب به مول بر مترمربع میباشد. مرحله جذب گاهی اوقات فعال سازی آنزیم را در بر میگیرد ( از طریق باز شدن در پوش جایگاه فعال آنزیم ) و بعد از این مرحله E* که در حالت انرژی مطلوبتری در سطح مشترک قرار گرفته از مدل سینتیکی میکائلیس-منتن پیروی میکند که به یک مولکول سوبسترا اتصال مییابد و کمپلکس E*S را تشکیل میدهد که میتواند هیدرولیز شود و محصول را آزاد کند. غیر فعال شدن برگشت پذیر E* توسط مرحله E*?E*i نشان داده میشود که با مرحله تشکیل E * S رقابت میکند. طرح شماتیکی از این واکنش در شکل زیرآمده است.
شکل 1-10- طرح شماتیکی واکنش لیپولیز
1-5-8-3-روش های اندازهگیری فعالیت لیپاز:
اندازهگیری فعالیت لیپولیتیکی به دلیل اینکه لیپازها آنزیمهای محلول در آب بوده در حالیکه سوبسترای آنها محلول در آب نمیباشد، بسیار مشکل است، روش های زیادی برای اندازهگیری فعالیت لیپاز بررسی و گزارش شده است. بیشتر این روشها براساس تخمین محصول حاصل از واکنش های هیدرولیزی طراحی شدهاند. عیارسنجی27، اندازهگیری کشش بینسطحی28، اسپکتروفتومتری29، کروماتوگرافی30، ایمونوشیمی31 و هدایت سنجی32 از روشهای ارزیابی فعالیت لیپاز هستند. البته میزان فعالیت لیپاز را میتوان توسط اندازهگیری میزان سرعت ناپدید شدن سوبسترای تری گلیسرید، میزان سرعت تولید اسید چرب و یا میزان سرعت تغییر رنگ امولوسیون محاسبه کرد]40 [.
در این تحقیق فعالیت لیپازسودوموناس بادو روش:1- استفاده از روش پارانیتروفنیل پالمیتات33 (pNPP) و2-کیت تشخیصی کمی Lipase DC در سرم یا پلاسما به روش فتومتریک اندازهگیری شده است که در فصل سوم به تفصیل بیان خواهد شد.
1-6- تثبیت34 آنزیم:
آنزیم در واکنشی که به عنوان کاتالیزور استفاده میشود تغییر نمییابد پس قابلیت استفاده دوباره را دارد، اما از آنجاییکه آنزیمها پروتئینهای کروی

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *