مقایسه فعالیت پاداکسایشی عصاره‌های اتانولی و متانولی ترکیبات فنولی در بخش‌های خوراکی …

۲۱-کشمش باعث تقویت اعصاب می‌شود.
۲۲-کشمش، سستی و رخوت را از بدن دور می‌کند.
۲۳-با خوردن کشمش، غضب را از خود دور کنید.
۲۴-کشمش موجب از بین رفتن آب اضافی بدن می‌گردد.
۲۵-کشمش، دهان را خوشبو می‌کند.
۲۶-کشمش، اسپاسم یا گرفتگی عضلانی را کم می‌کند.
۱-۶- سابقه تحقیق
انگور به عنوان یکی از بزرگترین محصولات میوه‌ای جهان شناخته شده است. میوه انگور حاوی مقادیر قابل توجهی ترکیبات فلاونوئیدی و همچنین حاوی املاح پتاسیم، منیزیم، سدیم، آهن، کلسیم، روی و مس می‌باشد (زرگری، ۱۳۷۶). در سال‌های اخیر تحقیقات زیادی بر روی مقایسه ترکیبات فنولی و فعالیت پاداکسایشی عصاره‌‌های بخش‌های مختلف انگور از جمله گوشت، پوست و برگ صورت گرفته است. که در این بین مقایسه بین برگ، غوره، میوه رسیده و خشک شده کمتر مورد توجه واقع شده است.
Orhan و همکاران (۲۰۰۸) به مطالعه فعالیت‌های بیولوژیکی برگ‌های انگور پرداختند. در این تحقیق محتوای فنول کل، برخی فعالیت‌های پاداکسایشی و ضد ویروسی برگ‌های انگور به منظور استفاده در صنایع دارویی مطالعه شد. Katalinic و همکاران (۲۰۱۰) محتوای فنولی و پاداکسایشی عصاره پوست میوه ۷ رقم انگور سفید و ۷ رقم انگور قرمز را مطالعه کردند. مقدار فنول کل موجود در پوست ارقام قرمز بیشتر از سفید گزارش شد.
در سال ۲۰۰۷ مطالعه‌ای توسط Chiou و همکاران بر روی محتوای فنولی و فعالیت پاداکسایشی کشمش سه زیر رقم انگور که هر کدام از سه منطقه مختلف یونان جمع آوری شده بود صورت گرفت. مقدار فنول کل بین زیر ارقام مختلف و مناطق مختلف متفاوت بود و با مقادیر فنول بدست آمده از پوست انگور تازه مشابه بود.
۱-۷- هدف
هدف از تحقیق حاضر بررسی و مقایسه فعالیت‌های پاداکسایشی و جاروب کنندگی رادیکال‌های آزاد، توسط دو حلال اتانول و متانول در عصاره‌های استخراجی از برگ، غوره، انگور و کشمش یک رقم انگور (رقم کشمشی قرمز) جمع آوری شده از روستای امامزاده ارومیه است که چنین مطالعه ای در نوع خود جدید می‌باشد.
فصل دوم
مواد و روش‌ها
۲- فصل دوم: مواد وروش‌ها
۲-۱- جمع آوری نمونه‌ها و فراهم کردن مواد گیاهی
در این تحقیق برگ‌های بالغ و سالم و غوره (میوه نارس) انگور رقم کشمشی قرمز در خرداد ماه ۹۱ از روستای امامزاده جمع آوری شدند، انگور (میوه رسیده) در اواخر شهریور ۹۱ جمع آوری شدند. سپس این نمونه‌ها در فریزرͨ ۸۰- تا زمان عصاره‌گیری نگهداری شدند. کشمش(میوه خشک شده) در اوایل مهر تهیه شد. کشمش به روش سنتی و با پهن کردن انگور بر روی خاک (ورزن) و با استفاده از گرمای نور خورشید تهیه شد.
۲-۲- عصاره‌گیری
بطور جداگانه مقدار ۱۵ گرم از برگ‌ها، ۲ گرم از انگور، غوره و کشمش در هاون چینی کوبیده شد و سپس به صورت جداگانه با ۱۵ میلی‌لیتر از محلول‌های متانول و اتانول در دمای اتاق بر روی تکان دهنده مغناطیسی به مدت ۳ ساعت عصاره گیری شدند. سپس محلول حاصل با کاغذ صافی واتمن صاف شدند و حجم به ۲۵ میلی‌لیتر رسانده شد. قرار گرفتن عصاره در معرض هوا و نور می‌تواند ترکیبات فنولی آن را تحت تاثیر قرار دهد، به همین دلیل درب ظرف حاوی مخلوط توسط نوار پارا فیلم بسته و بدنه ظرف نیز به وسیله کاغذ آلومنیومی پوشانده شد، سپس برای انجام آزمایش‌های مختلف در یخچال ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شدند (Kamkar et al., 2011).
۲-۳- تعیین محتوای فنل کل
محتوای فنلی کل به وسیله معرف Folin-Ciocalteu و طبق روش Horwits (1984) تعیین شد. طبق این روش به ۵۰ میکرولیتر از عصاره‌ی گیاهی، ۱ میلی لیتر معرف Folin-Ciocalteu ده برابر رقیق شده، ۱ میلی لیتر محلول کربنات سدیم ۱۰ درصد پس از ۳ دقیقه، اضافه گردید. محلول حاصل به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق انکوبه شد و سپس جذب آن در ۷۵۰ نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری خوانده شد. محتوای فنل کل با استفاده از منحنی استاندارد گالیک اسید (ضمائم، نمودار ۱) تعیین گردید.
۲-۴- تعیین محتوای فلاوونوئیدی
برای تعیین محتوای فلاونوئیدی موجود در بخش‌های مختلف گیاهان ابتدا ۲۰ میکرولیتر از عصاره گیاهی با ۱ میلی لیتر آب مقطر رقیق سازی شده و ۰۷۵/۰ میلی لیتر از نیتریت سدیم (۵٪) به آن اضافه شد. بعد از ۵ دقیقه از انجام واکنش ۱۵/۰ میلی لیتر کلرید آلومنیوم (۱۰٪) اضافه شد بعد از ۶ دقیقه از انجام واکنش ۵/۰ میلی لیتر هیدروکسید سدیم (یک مول بر لیتر) اضافه گردید و به حجم نهایی ۳ میلی لیتر رسانده شد و جذب آن در ۵۱۰ نانومتر تعیین شد. محتوای فلاونوئید کل با استفاده از منحنی استاندارد کوئرستین (ضمائم، نمودار۲) تعیین گردید.
۲۵- ظرفیت جمع آوری رادیکال نیتریک اکسید
به منظور جمع آوری رادیکال‌های آزاد نیتریک به ۴۰ میکرولیتر از عصاره ۵/۰ میلی لیتر بافر فسفات سالین(۱۰ میلی مولار) و ۲ میلی‌لیتر سدیم نیتروپروسید(۱۰ میلی مولار) اضافه گردید و در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵۰ دقیقه انکوبه گردید. سپس ۵/۰ میلی‌لیتر از محلول فوق با ۱ میلی‌لیتر سولفانیلیک اسید (۳۳/۰٪ در گلاسیال استیک اسید۱۰٪) مخلوط شد و به مدت ۵ دقیقه جهت تکمیل واکنش در حال استراحت گذاشته شدند. بعد از آن ۱ میلی لیتر نفتیل اتیلن دی آمین دی هیدروکلراید (۱/۰٪) اضافه شده و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. یک رنگ صورتی پخش شده در محلول ایجاد گردید. جذب آن در ۵۴۰ نانومتر اندازه گیری شد. درصد مهار از فرمول زیر محاسبه گردید (Garrat, 1964).
= (Ablank – Asample ) * ۱۰۰/ A sampleدرصد جمع آوری رادیکال نیتریک اکسید
ABlank = جذب مخلوط واکنش بدون عصاره
ASample = جذب مخلوط واکنش حاوی عصاره
۲-۶- تعیین درصد جمع آوری رادیکال سوپراکسید
برای سنجش رادیکال آنیون سوپراکسید، رادیکال‌های آنیون سوپراکسید بوسیله یک سیستم اتواکسیداسیون پیروگالول ایجاد شدند (Mazza and Minitiati, 1993). 9 میلی‌لیتر از محلول بافر تریس-اسیدکلریدریک (۲/۸ =pH ,50 میلی‌مول بر لیتر) به لوله‌ی آزمایش اضافه شد و لوله‌ی آزمایش به مدت ۲۰ دقیقه در بن ماری در دمای ۲۵ درجه‌ی سانتی‌گراد انکوبه گردید. ۴۰ میکرولیتر از محلول پیروگالول (۴۵ میلی‌مول بر لیتر پیروگالول در اسید کلریدریک ۱۰ میلی مول بر لیتر)، که قبلا در ۲۵ درجه سانتی‌گراد انکوبه شده بود، با استفاده از یک سرنگ میکرولیتری به قسمت بالایی لوله‌ی آزمایش تزریق شده و مخلوط گردید. مخلوط برای ۳ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد انکوبه گردید و سپس بلافاصله ۱ قطره اسیدآسکوربیک برای پایان واکنش به داخل مخلوط چکانده شد. جذب مخلوط در ۴۲۰ نانومتر به عنوان A پس از ۵ دقیقه ثبت شد و این A سرعت اتواکسیداسیون پیروگالول را نشان می‌دهد. سرعت اتواکسیداسیون A1 از همان روش بالا گرفته شد فقط به بافر تریس میزان مشخصی از عصاره (۱۰ میکرولیتر) افزوده شد. همزمان یک بلانک کنترل از مواد واکنشی (۹ میلی‌لیتر از محلول بافر تریس- اسیدکلریدریک، ۴۰ میکرولیتر از محلول پیروگالول و ۱ قطره اسید آسکوربیک بدون عصاره) به عنوان Aدر نظر گرفته شد. درصد جمع آوری رادیکال با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید:
درصد جمع آوری رادیکال‌های سوپراکسید = A– (A1-A2* ۱۰۰ / A0
۲-۷- سنجش درصد جمع آوری رادیکال DPPH (2،۲- دی فنیل- ۱- پیکریل هیدرازیل)
میزان جاروب کنندگی رادیکال پایدار DPPH (2،۲- دی فنیل ۱- پیکریل هیدرازیل) طبق روش Bucar و Burits (2000) با کمی تغییر تعیین شد. ۴۰ میکرولیتر از عصاره با ۲ میلی‌لیتر محلول متانولی (۰۰۴/۰٪) DPPH مخلوط شد. جذب مخلوط بعد از ۳۰ دقیقه انکوباسیون (در دمای اتاق و تاریکی) در طول موج ۵۱۷ نانومتر خوانده شد. درصد فعالیت جاروب کنندگی عصاره‌ها طبق فرمول زیر محاسبه گردید.
۱۰۰× ( ABlank / ASample -۱ )= درصد مهار رادیکال DPPH
جذب مخلوط واکنش بدون عصاره ABlank =
جذب مخلوط واکنش حاوی عصاره ASample =
۲-۸- قدرت احیای آهن با استفاده از سنجش FRAP
قدرت احیای آهن با استفاده از سنجش (Ferric Reducing Antiozidant Power) FRAP با روش Benzie و Strain (1996) با اندکی تغییر تعیین شد. معرف FRAP حاوی ۵/۲ میلی‌لیتر از TPTZ 10 میلی‌مولار در HCl 40 میلی مولار و ۵/۲ میلی‌لیتر از FeCl320 میلی‌مولار از بافر استات ۳/۰ مولار (۶/۳( pH= به طور تازه تهیه شد. ۱۰ میکرولیتر از هر عصاره با ۳ میلی‌لیتر از معرف FRAP مخلوط گردید و جذب واکنش در طول موج ۵۹۵ نانومتر اندازه‌گیری شد. محلول‌های متانولی با غلظت مشخص Fe (ІІ)، به مقدار ۱۰۰۰- ۶۰ میلی مول بر لیتر (FeSO4)، برای بدست آوردن منحنی استاندارد (ضمائم، نمودار۳) استفاده گردید.
۲-۹- سنجش ظرفیت مهار پراکسیداسیون چربی با روش تیوباربیوتیک اسید (TBA)
روش تیوباربیوتیک برای محاسبه میزان پراکسیداسیون لیپید به کار رفته است. در pH پایین و در دمای بالا (۱۰۰ درجه سانتی گراد )، مالون دی آلدهید (MDA) به TBA باند شده و تشکیل یک کمپلکس قرمز رنگ می‌دهد که می‌توان آن را در ۵۳۲ نانومتر تشخیص داد (Eshbaugh, 1975). 2 میلی لیتر تری کلرواستیک اسید ۲۰ درصد و ۲ میلی لیتر از محلول TBA 67/0 درصد به ۲ میلی‌لیتر از عصاره نمونه‌های گیاهی اضافه شد. این مخلوط به مدت ۱۰ دقیقه در بن ماری ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد قرار گرفت و پس از سرد کردن تا دمای اتاق، به مدت ۲۰ دقیقه در سرعت ۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ شد. فعالیت ضداکسایشی بر اساس جذب محلول رویی در ۵۳۲ نانومتر می‌باشد که بر اساس فرمول زیر قابل محاسبه است:
(رقت × ۱۰۰۰ ×(۱۵۵/ جذب ) μgMDA/g F.w =

نوشته ای دیگر :
مقایسه فعالیت پاداکسایشی عصاره‌های اتانولی و متانولی ترکیبات فنولی در بخش‌های خوراکی انگور۹۳ (Vitis vinifera L ...

برای دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت  jemo.ir  مراجعه نمایید.