دانلود پایان نامه

استخراج کرده تا روغن و چربی وارد فاز هگزانی شود وعمل حلال زدایی را مانند قسمت بالا انجام داده در یخچال نگهداری می کنیم.
2-3-2- تعیین بازده عصاره‌گیری
با استفاده از وزن گیاه خشک مورد استفاده در عصاره گیری و وزن عصاره بدست آمده بازده عصاره به صورت نسبت وزنی/ وزنی w/w ) (محاسبه شد که حاصل‌ضرب این نسبت در 100 راندمان عصاره‌گیری رابرحسب درصد مشخص می کند.

2-4- استخراج ترکیبات فرار گیاهی
برای استخراج ترکیبات فرار بخش‌های مختلف گیاه، از روش تقطیر واستخراج همزمان و از دستگاه SDE استفاده شد. 200 گرم از گیاه خشک آسیاب شده را پس ازتوزین به بالن 2 لیتری منتقل شد و برروی آن آنقدرآب اضافه شد که مجموع نمونه گیاهی وآب حدود □(2/3) حجم بالن را اشغال نماید . حدود 35 میلی لیتر پنتان دربالن 100 میلی لیتری دستگاه ریخته وبالن‌ها رادرون شوف بالن (منتل) قرارداده ودستگاه اسانس‌گیری راه اندازی شد . پس از برقراری جریان آب سرد درمبرد دستگاه و تنظیم درجه حرارت بالن‌ها عمل اسانس گیری به مدت 2 ساعت ادامه یافت. پس از اتمام عمل استخراج مقداری سدیم سولفات بدون آب درون اسانس همراه با پنتان برای جذب آب احتمالی موجود در آن اضافه شد، سپس اسانس حاصل به مدت 24 ساعت درون یخچال قرار دادهوپس از مدت حدوداً 24 ساعت درون ویال تیره رنگی سرریز شد و به منظور تغلیظ اسانس و تبخیر حلال ساعاتی در دمای آزمایشگاه قرار داده شد و در دمای 4+ درجه سانتی گراد برای تزریق به دستگاه GC نگهداری شدند. در ضمن از تفاضل وزن ویال پس از جمع آوری اسانس درآن و قبل از آن، وزن خالص ترکیبات فرار محاسبه گردید.
2-4-1- تعیین بازده اسانس‌گیری
با استفاده از وزن گیاه خشک مورد استفاده در اسانس گیری و وزن اسانس بدست آمده بازده اسانس به صورت نسبت وزنی/وزنی (w/w) محاسبه شد که حاصل ضرب این نسبت در 100، بازده اسانس گیری را برحسب درصد مشخص می کند.
2-4-2- شناسایی ترکیب‌های فرار گیاه با دستگاه GC-MS
نمونههای ترکیبات فرار گیاهی با دستگاه GC/MS حاوی ستون HP- 5MS (طول 30 متر، قطر داخلی 25/0 میلیمتر، ضخامت لایه ساکن ۲۵/0 میکرومتر) و گاز حامل هلیم با درجه خلوص ۹۹999/۹۹ آنالیز شدند. در ضمن سرعت جریان گاز حامل 5/1 میلی‌لیتر بر دقیقه و انرژی یونیزاسیون در طیفسنج جرمی ۷۰ الکترون ولت انتخاب گردید. برنامه دمایی دستگاه به این صورت تنظیم گردید: ابتدا دما به مدت ۲ دقیقه در 60 درجه سانتیگراد نگه داشته شد، سپس به دمای 246 سانتیگراد با سرعت 3 درجه بر دقیقه افزایش یافت، و به مدت ۲ دقیقه دراین دما باقی ماند، سپس به دمای ۲8۰ سانتیگراد افزایش یافته و به مدت 10 دقیقه در این دما باقی ماند .
برای شناسایی ترکیبهای فرار گیاه، مراحل زیر انجام گرفت.
الف) با توجه به پیشنهادهایی که کتابخانه دستگاه GC-MS ارائه داد؛ هر یک از آنها جداگانه مورد بررسی قرار گرفت.
ب) طیف‌های جرمی به دست آمده با طیف‌های موجود در کتاب Adams مقایسه گردید [50].
ج) با توجه به زمان بازداری هر پیک، ضریب بازداری کواتس KI ) (هر یک از طریق معادله مربوط به محاسبه ضریب کواتس به دست آمد و با ضریب کواتس موجود در منابع (کتاب Adams و سایت NIST) در شرایط مشابه مقایسه گردید.
2-5- بررسی فعالیت ضد اکسیدانی
2-5-1- بررسی فعالیت ضد اکسیدانی به روش DPPH
در این پروژه خاصیت ضد اکسیدانی عصاره اندام‌های مختلف گیاهان Morina persica L. و Physospermum cornubiense (L.) DC. از طریق اندازه گیری ظرفیت کاهش رادیکال DPPH (2، 2- دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل) مورد بررسی قرار گرفت. دراین ارزیابی توانایی عصاره گیاهی (به عنوان ضد اکسیدان) در دادن الکترون به رادیکال DPPH مورد سنجش قرار گرفت.
تهیه محلول‌ها
محلول DPPH : میزان 7/4 میلی گرم از DPPH با ترازوی آنالیتیکی به طور دقیق وزن ودربالن ژوژه 50 میلی لیتری تیره رنگ بامتانول به حجم رسید . محلول بدست آمده رنگ ارغوانی داشت.
محلول شاهد : میزان 1 میلی‌لیتر از متانول که به آن 1 میلی لیتر از محلول DPPH اضافه شد. (جذب آن باید در بازه 7/1-1/1باشد.)
الف) نمونه استانداردBHT
برای بررسی خاصیت ضد اکسیدانی عصارههای گیاهی، مقایسه نتایج به دست آمده از این عصارهها، با مواد ضد اکسیدان استاندارد، امری ضروری است. یکی از این مواد استاندارد بوتیل هیدروکسی تولوئن میباشد.
غلظت‌های 1، 8/0، 5/0، 25/0، 1/0، 05/0،0 005/0، 0005/0و 00005/0 میلی گرم بر میلی لیتر در 8 عدد بالن ژوژه 10 میلی لیتر تهیه گردید. سپس 8 عدد بالن ژوژه 5 میلی لیتر هم تهیه شد که 1 میلی لیتر از هر کدام از این محلولها را به درون بالنها انتقال یافت. بعد 1 میلی لیتر از محلول DPPH تهیه شده به این بالنها اضافه شد. همچنین در یک بالن 5 میلی‌لیتر دیگر 1 میلی لیتر متانول و 1 میلی لیتر از DPPH به عنوان شاهد اضافه گردید. پس از 30 دقیقه، محلول‌های با غلظت ضد اکسیدان بیشتر در اثر احیا از بنفش به زرد تغییر رنگ پیدا کرد. سپس جذب هر کدام از محلولها را با صفر کردن توسط محلول متناظر، در طول موج 517 نانو متر با دستگاه UV/Vis خوانده شد. برای خواندن جذب محلول شاهد از متانول مرک به عنوان استاندارد برای صفر کردن دستگاه استفاده شد. پس از محاسبه درصد مهار برای هر غلظت طبق رابطه مذکور در قسمت بعدی، نمودار درصد مهار بر حسب منفی لگاریتم غلظت (میلی گرم بر میلی لیتر) رسم شد.
ب) عصاره‌های گیاهی : از عصاره‌های گیاهی به‌طور مجزا یک غلظت پایه تهیه شد به این ترتیب که 25 میلی‌گرم از هر عصاره به‌طور جداگانه توزین شد ودریک بالن ژوژه 25 میلی لیتر با متانول به حجم رسانده شد. پس ازتهیه
محلول پایه برای عصاره چند غلظت رقیقتر هم طبق غلظت هایی که در مورد BHT گفته شد تهیه گردید. تهیه محلولهای عصاره از محلول پایه به روش رقیق سازی متوالی انجام شد. به 1 میلی لیتر از هر محلول عصاره 1 میلی لیتر از محلول DPPHاضافه شد. محلولهای شاهد وعصاره به مدت نیم ساعت در فضای تاریک نگه داری شد ودر طول این مدت مقداری تکان داده شد تا محلولها کاملاً همگن شوند. جذب هریک از این محلول ها با دستگاه UV/Vis در طول موج 517 نانومتر قرائت شد. درهرمرحله از خواندن جذب به شاهدی برای صفر کردن دستگاه لازم است که حاوی مواد شیمیایی یکسان با آن ( حلال و نمونه گیاهی ) وفاقد رادیکال آزاد DPPH است. در صد مهار با فرمول زیر محاسبه شد:

در این فرمول Ablank و Asample به ترتیب میزان جذب شاهد ونمونه می باشند . مقدار IC50 نشان دهنده غلظتی از ترکیب است که موجب 50% بازدارندگی در ظرفیت رادیکالی می‌گردد سپس منحنی درصد مهار برحسب منفی لگاریتم غلظت رسم شد و با کمک آن IC50 قابل محاسبه است. (این آزمون سه مرتبه تکرار شد).
در مورد گیاه Physospermum cornubiense (L.) DC. همه غلظت های عصاره گیاهی سر شاخه 2 برابر شده تا درصد مهار غلیظ ترین محلول بیشتر از 90٪ باشد.
2-5-2- اندازه‌گیری مقدار کل ترکیبات فنلی
برای اندازه گیری مقدار کل ترکیبات فنلی از روش فولین- سیکالتو و گالیک اسید به عنوان استاندارد استفاده شد .
تهیه محلول 2% سدیم کربنات : میزان 7/2 گرم از سدیم کربنات در بالن ژوژه 50 میلی لیتری با آب تقطیر شده به حجم رسید .
تهیه محلول شاهد : 2/0 سی سی حلال DMSO، یک میلی لیتر معرف فولین سیوکالتو وپس از گذر سه دقیقه زمان، 3 میلی لیتر محلول سدیم کربنات 2% به بالن ژوژه 50 میلی لیتری منتقل و با آب مقطر به حجم رسید.
محلول‌های استاندارد گالیک‌اسید: محلول‌هایی از گالیک‌اسید با غلظت‌های 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9 و10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تهیه شد. 1/0میلی‌لیتر از هریک از محلول‌ها به بالن‌های50 میلی‌لیتری حاوی آب مقطر افزوده شد. سپس به همه بالن‌ها 1میلی‌لیتر معرف فولین‌سیوکالتو اضافه شد. بعد از 3 دقیقه، 3 میلی‌لیتر محلول سدیم‌کربنات %2 افزوده و بالن‌ها با آب مقطر به حجم رسانده شد و به مدت 2 ساعت در محیط آزمایشگاه نگه داشته شد.
تهیه محلول از عصاره : میزان 10 میلی گرم از عصاره مورد نظر به طور دقیق با ترازوی آنالیتیکی وزن و در لوله آزمایش ریخته شد سپس میزان 2 میلی لیتر حلال DMSO به آن افزوده و در اثر هم زدن پیوسته با همزن ارتعاشی حل گردید .
سه نمونه از عصاره در سه بالن ژوژه50 میلی لیتری با مشخصات ذیل تهیه گردید.
میزان 2/0 میلی لیتر از محلول عصاره را برداشته وداخل بالن ژوژه 50 میلی لیتر ریخته و بر روی آن حدود 35 میلی لیتر آب مقطر اضافه نموده وسپس 1 میلی لیتر از معرف فولین- سیکالتو افزوده و به خوبی مخلوط گردید . بعد از 3 دقیقه، 3 میلی لیتر از محلول سدیم کربنات 2% افزوده و با آب مقطر به حجم 50 میلی لیتر رسید. محلول‌ها به مدت 2 ساعت در دمای آزمایشگاه نگه داشته شد. در طول این مدت مقداری تکان داده شد تا محلول‌ها کاملاً همگن شوند پس از صفرکردن جذب با محلول شاهد جذب هریک از محلول‌ها بادستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 760 نانومتر قرائت شد .
با استفاده از جذب‌های به دست آمده از محلول‌های استاندارد گالیک‌اسید، نمودار جذب- غلظت رسم شد و معادله خط آن محاسبه گردید. با قراردادن مقدار جذب عصاره‌ها در این معادله، مقدار معادل گالیک اسید ترکیب های فنلی گیاه به دست آمد. مقدار کل ترکیب های فنلی هم ارز با وزن گالیک اسید در عصاره گیاه، از طریق معادله خط منحنی کالیبراسیون زیر به صورت محاسباتی قابل تعیین است .

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منبع پایان نامه ارشد دربارهکاشت، ab، بیوماس، لاین

Absorbance = 0012/0 × Gallic acid (µg/mg) 0033/0 +

2-5-3- آزمایش بی‌رنگ شدن بتاکاروتن در حضور لینولئیک‌اسید
الف. برای انجام این آزمایش ابتدا محلولهای زیر تهیه شد.
میزان 250 میلی لیتر آب مقطر در ارلن ریخته و جریان مداومی از گاز اکسیژن به مدت 1 ساعت همراه با اختلاط به داخل آن وارد شد تا از اکسیژن اشباع شود.
مقدار 20 میلی‌گرم از هر یک از نمونهها در 10 میلی لیتر دی متیل سولفوکسید حل گردید.
مقدار 20 میلی‌گرم از شاهد مثبت BHT در 10 میلی لیتر دی متیل سولفوکسید حل گردید.
مقدار 7/5 میلی گرم بتاکاروتن در یک بالن ژوژه 10 میلی لیتر ریخته و با کلروفرم (HPLC grade) به حجم رسانده شد.
مقدار 38/56 میلی گرم لینولئیک اسید در بالن ژوژه 5 میلی لیتر ریخته و با کلروفرم به حجم رسانده شد.
بالن‌اول: مقدار 300 میلی گرم توئین 40 در بالن 250 میلی لیتر و بالن‌دوم : مقدار200 میلی گرم توئین 40 در بالن 250 میلی لیتر دیگر ریخته شد.
ب. تهیه محلولهای نهایی و انجام آزمایش
به بالن اول مقدار 3 میلی لیتر و به بالن دوم مقدار 2 میلی لیتر از محلول شماره 5 اضافه شد.همچنین به بالن اول حاوی توئین مقدار 5/1 میلی لیتر از محلول شماره 4 اضافه شد.
با استفاده از تبخیر کننده دوار حلال کلروفرم موجود در هر دو بالن تبخیر و به بالن اول 150 میلی لیتر و به بالن دوم 100 میلی لیتر از آب مقطر اشباع از اکسیژن اضافه و خوب مخلوط شد.
برای هریک از نمونهها، شاهد مثبت وشاهد منفی 3 عدد لوله آزمایش هرکدام حاوی مقدار 350 میکرولیتر از نمونهها (محلول شماره الف-2)، شاهد مثبت (محلول شماره الف-3) و شاهد منفی (حلال مورد استفاده برای تهیه نمونهها) تهیه گردید. همچنین برای هر یک از نمونهها، شاهد مثبت و شاهد منفی یک لوله آزمایش حاوی مقدار 700 میکرولیتر از نمونهها (محلول شماره 2)، شاهد مثبت (محلول شماره 3) و شاهد من
فی (حلال مورد استفاده برای تهیه نمونهها) تهیه شد (محلولهای شاهد). به سری 3 تایی لولهها مقدار 5/2 میلی لیتر از محلول بالن 250 میلی لیتر اول و به سری یک تایی مقدار 5 میلی لیتر از محلول بالن 250 میلی لیتر دوم اضافه گردید.
قبل از افزودن محلول (4-الف) به لوله‌های آزمایش عصاره‌ها و شاهد مثبت، این محلول به لوله‌های شاهد منفی افزوده و پس از 2 ساعت ماندن در دمای 50 درجه سانتی‌گراد، اسپکتروفتومتر (UV-Vis) با سری یکتایی محلول‌های شاهد منفی در طول موج 470 نانومتر صفر و جذب سری سه تایی شاهد منفی در این طول موج سه بار خوانده شد. میانگین جذبها در طول موج نام برده باید بین 4/0 -3/0 به دست آید.
تمامی نمونهها و شاهدهای مثبت و منفی به مدت 2 ساعت در دمای 50 درجه سانتیگراد نگه داری شدند. پس از این مدت دستگاه را هر بار با محلولهای موجود در لولههای تکی مربوط به نمونهها، شاهد مثبت و منفی در طول موج 470 نانومتر صفر نموده و جذب مجموعههای سه تایی نمونهها و شاهدهای مثبت و منفی در این طول موج خوانده شد و با استفاده از رابطه ذیل درصد مهار لینولئیک ‌اسید محاسبه ‌گردید.

%I={1- (As (t=0) – As (t=2h))/ (Ac (t=0) – Ac (t=2h)) } )100

جذب نمونه‌ها در لحظه صفر : As (t=0)
جذب نمونه‌ها پس از 2 ساعت: As (t=2h)
جذب شاهد منفی در لحظه صفر:Ac (t=0)
جذب شاهد منفی پس از 2 ساعت:Ac (t=2h)
درصد مهار :%I
2-6- فعالیت ضدمیکروبی
2-6-1- روش انتشار در آگار (دیسک دیفیوژن)
تعیین فعالیتهای ضدمیکروبی عصارههای گیاهی با روش انتشار در آگار )1997، NCCLS) انجام شد. عصاره خشک گیاه در DMSO با غلظت نهایی 30 میلی گرم بر میلی لیتر حل شده و با فیلتر میلی‌پور 45/0 میکرومتراستریل شد. سپس 100 میکرولیتر از سوسپانسیون حاوی ml/CFU 108 از باکتری ها، CFU/ml 106 از مخمر و spore/ml104 بر روی محیط‌های کشت نوترینت آگار، سابرو دکستروز و پوتیتو دکستروز آگار اسپری شد. دیسک (با قطر6 میلیمتر) با 10 میکرولیتر از محلولهایی از عصاره‌ها آغشته شده (g/discµ300) و DMSO (به عنوان کنترل منفی) در آگار تلقیح شده قرار داده شد. صفحات آغشته شده به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتیگراد برای سویه‌های باکتریایی و در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت و 72 ساعت برای سویههای مخمر و کپک به صورت جدا در انکوباتور بودند. بر روی هر دیسک 10 میکروگرم از جنتامیسین و 5 میکروگرم از ریفامپین برای باکتری‌ها و I.U.100 نیستاتین برای قارچ به عنوان گروه کنترل مثبت مورد استفاده قرار گرفت. قطرهاله مهار با استفاده از خط‌کش آنتی‌بیوگرام اندازه‌گیری شد و به عنوان معیاری برای فعالیت ضد میکروبی مورد استفاده قرار گرفت. در هر مورد دیسک‌گذاری دو بار تکرار شد.
2-6-2- تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی رشد
در این روش حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) برای میکروارگانیسمهای حساس به عصارههای گیاهی با روش رقت‌سازی در محیط کشت مایع محاسبه گردید. برای این منظور صفحههای 96 خانهای استریل تهیه شد. به هر یک از خانهها 95 میکرولیتر محیط کشت مایع BHI، 5 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی با رقت 5/0 مک


دیدگاهتان را بنویسید