افزار spdbv مطالعه شدند. در نهایت همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، اپی توپ ها با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال انتخاب شدند. در اینجا ساختمان های پروتئین L1 از سروتایپ های HPV 11, 16, 18, 31, 45 نشان داده شده اند.

شکل4-1: نمایش انتخاب اپی توپ ها با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال ، در اینجا ساختمان های پروتئین L1 از سروتایپ های HPV 11, 16, 18, 31, 45 نشان داده شده اند
4-3-محل های N-Glycosylated
محل N-Glycosylated این اپی توپ ها با استفاده از سرور ensemblegly-Iowa پیش بینی شدند. اپی توپ های آنالیز شده در این سرور و موقعیت آسپاراژین که گیکوزیله شدند، تعیین شد. برای اطمینان از بیان این ساختمان در اشرشیا کولی، اپی توپ هایی که حتی یک محل N-Glycosylated دارند، در طرح ساختار نهایی کنار گذاشته شدند. جدول 3 امتیاز و محدوده آسپاراژین در توالی اپی توپ ها را نشان می دهد.
Position Residue Score Threshold Prediction
Position Residue Score Threshold Prediction
A
B
C
D

E
F

G
H
I
J

جدول4-3: امتیاز و محدوده آسپاراژین در توالی اپی توپ ها را نشان می دهد
(A: L1 HPV11, B: L2 HPV11 – C: L1 HPV16 – D: L2 HPV16 – E: L1 HPV18 – F: L2 HPV18 – G: L1HPV31 – H: L2 HPV31 – I: L1 HPV45 – J: L2 HPV45).
4-4-انتخاب اپی توپ ها و اتصال پپتیدها برای تولید ساختمان واکسن
بعد از ارزیابی امتیازات اپی توپ، 2 اپی توپ مطلوب برای هر نوع HPV انتخاب شدند. اپی توپ های پروتئین L1 و L2 سروتایپ 6 و 11 مشابه بودند، بنابراین یکی از اپی توپ ها برای هر دو انتخاب شد. در نهایت 20 اپی توپ را انتخاب شدند که توسط ترتیب شماره در جدول 4 بیان شده اند.

No.
Serotype
Protein
Start
Sequence Peptide
01
HPV 11
L1
128
NSGGYGGNPGQDNRVNVGMD
02
HPV 11
L1
169
GTQCSNTSVQNGDCPPLELI
03
HPV 11
L2
19
TCKATGTCPPDVIPKVEHTT
04
HPV 11
L2
105
SLIEESAIINAGAPEVVPPT
05
HPV 16
L1
152
LDDTENASAYAANAGVDNRE
06
HPV 16
L1
375
STSETTYKNTNFKEYLRHGE
07
HPV 16
L2
21
TCKQAGTCPPDIIPKVEGKT
08
HPV 16
L2
116
DAGAPTPVPSIPPDVSGFSI
09
HPV 18
L1
407
ASTQSPVPGQYDATKFKQYS
10
HPV 18
L1
457
NSSILEDWNFGVPPPPTTSL
11
HPV 18
L2
20
TCKQSGTCPPDVVPKVEGTT
12
HPV 18
L2
82
VDVGPTRPPVVIEPVGPTDP
13
HPV 31
L1
47
HPYYSIPKSDNPKKIVVPKV
14
HPV 31
L1
172
KGSPCSNNAITPGDCPPLEL
15
HPV 31
L2
21
TCKAAGTCPSDVIPKIEHTT
16
HPV 31
L2
84
EASIPIRPPVSIDPVGPLDP
17
HPV 45
L1
375
ASTQNPVPNTYDPTKFKHYS
18
HPV 45
L1
425
NSSILENWNFGVPPPPTTSL
19
HPV 45
L2
20
TCKQSGTCPPDVINKVEGTT
20
HPV 45
L2
82
VDVGPTRPPVVIDPVGPTDP

جدول4-4: 20 اپی توپ مناسب انتخاب شده از پروتئین های L1 و L2
در نهایت 20 اپی توپ مناسب انتخاب شده از پروتئین های L1 و L2 به همدیگر متصل شدند و اولین ساختمان این ساختار ایجاد شد. ترتیب متوالی آنها توسط ترتیب ظاهرشان در جدول 4 تعیین شد و E1 تا E10 را برای پروتئین L1 مربوطه و E11 تا E20 را برای L2 طراحی شدند.

شکل4-2:طراحی اولیه ساختار اپی توپ های منتخب ، E1 تا E10 برای پروتئین L1 و E11 تا E20 برای L2 طراحی شدند.
4-5-ارزشیابی توالی پروتئین
توالی های ساختمان اولیه در ابزار Expasy’s protParam آنالیز شدند و نتایج در جدول 6 نشان داده شدند. نتایج نشان می دهد که وزن مولکولی پروتئین طراحی شده 41.8 kDa بوده و 400 اسید امینه دارد. چون تعداد کل اسیدآمینه های باردار مثبت تقریباً دو برابر اسید آمینه های باردار منفی هستند، ارزش نقطه ایزوالکتریک محاسبه شده کمتر از 7 بود که ماهیت اسیدی محصول نهایی را نشان می دهد. شاخص آلفاتیک نشان می دهد که این ساختار پایداری حرارتی پایین دارد. ارزش های هیدروپاتی سیتی بطور متوسط منفی بود. به علاوه، ترکیب اسید آمینه نشان داد که فراوان ترین اسید آمینه در ساختار طراحی شده به ترتیب عبارت بودند از گلوتامیک و لوسئین (جدول 5).
AC.
E2 protein
Number of amino acids
400
Theoretical pI
4.71
Mol. Wt
41.8597
positively charged residues (Arg + Lys):
28
negatively charged residues (Asp + Glu):
44
Formula:
C1831H2875N485O606S15
Instability index
41.77
Total number of atoms:
5812
AI, GRAVY
64.00, -0.494
جدول 4-5: نتایج طراحی پروتئین و محاسبه پارامترهای مربوطه
Mol. Wt – Molecular Weight; pI- Theoretical Isoelectric Point; AI – Aliphatic Index; GRAVY – Grand verage Hydropathicity.

آنتی ژنی سیتی ساختمان توسط برنامه پروتئان آنالیز شد. این نتایج نشان داد که قسمت های اصلی ساختار پروتئنی جدید خصوصیات هیدروفیلیک دارد، بنابراین توان آنتی ژنیک را دارد (شکل4 -3).
شکل 4-3: آنالیز آنتی ژنی سیتی ساختمان توسط برنامه پروتئان آنالیز ،. این نتایج نشان داد که قسمت های اصلی ساختار پروتئنی جدید خصوصیات هیدروفیلیک دارد، بنابراین توان آنتی ژنیک را دارد
4-6-ترجمۀ معکوس ساختمان اول
بعد از تایید آنتی ژنی سیتی پروتئین جدید، توالی های اسید آمینه این ساختار توسط سرور مناسب دستکاری توالی به نوکلئوتید ترجمه شدند. این فرایند بر اساس جدول کاربرد کدون هدایت می شود و توالی همگانی (اتفاق نظر) گرفته شده از همه کدون های احتمالی نیز برگردانده می شود. توالی ترجمه شده معکوس برای بهینه سازی کدون و کدون نادر برای افزایش سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین ارزشیابی شد. به این منظور OPTIMIZER و سرورهای GenScript با هم بکار برده شدند. این اطلاعات برای پیش بینی این مورد که ژن ساختار نهایی در میزبان E.coli به خوبی بیان خواهد ش
د، بسیار مفید است. یکCAI 1.0 در حالی ایده آل در نظر گرفته می شود که CAI 0.8 به عنوان یک بیان خوب در ارگانیسم مورد نظر رتبه بندی شود. هرچه تعداد محتوا پایین تر باشد، احتمال اینکه ژن مورد نظر بطور ضعیف بیان شود بالاتر است. ابزار بهینه سازی کدون ژن GenScript Optimum می توانند توالی مورد نظر را ارتقا داده تا به یک CAI بالاتر از 0.8 برسد. محتوای GC ژن این مطالعه 54.265 است. محدودۀ درصد ایده آل محتوای GC بین 30% تا 70% است. هرگونه طیف خارج از این محدود اثر منفی بر نسخه برداری و ترجمه دارد. نتایج در شکل 4 نشان داده شده اند.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   مقاله درمورد دانلودامام صادق

شکل4-4: توالی ترجمه شده معکوس برای بهینه سازی کدون و کدون نادر برای افزایش سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین ارزشیابی شد. به این منظور OPTIMIZER و سرورهای GenScript با هم بکار برده شدند

ششکل 4-5: نتایج ترجمه معکوس و بهینه سازی کدون در E.coli
4-7-نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش SDS-PAGE
به منظور بررسی بیان پروتئین مربوط به ژن HPV در سلول های پروکاریوت، پلاسمید نوترکیب pET28a(+)/HPV به دست آمده ، بعد از القاء و کشت 4 ساعته لیز شدند و سپس با SDS-PAGE پروتئین های با وزن های مولکولی مختلف از یکدیگر جدا شدند.این عمل قبل و بعد از تخلیص صورت گرفت که نتایج حاکی از بیان پروتئین در محدوده 45 کیلو دالتون است.

شکل 4-6: نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی و مشاهده باند در محدوده 45 کیلو دالتون.
M مارکر پروتئینی،A نمونه بدون القا، B نمونه ساعت 4 با غلظت 1 میلی مولار IPTG،C نمونه ساعت 3 با غلظت های 1 میلی مولار IPTG ،D نمونه ساعت 2 با غلظت 1 میلی مولار IPTG ، E نمونه ساعت 1 با غلظت 1 میلی مولار IPTG ،F نمونه مایع رویی که نشانده نداشتن باند در مایع رویی است بنابراین پروتئین مذکور به صورت inclusion body در سیتوزول است و بهترین بیان در ساعت 4 و در محدوه 45 کیلو دالتون است.

شکل4-7: pET28a(+)/HPV، SDS-PAGE قبل و بعد از تخلیص پروتئین ، نتیجه تخلیص به صورت تک باند و در محدوده 45KD است.
M مارکر پروتئینی، نتایج قبل از تخلیص: A نمونه ساعت 4 با غلظت 1 میلی مولار IPTG، B نمونه ساعت 3 با غلظت 1 میلی مولار IPTG، C نمونه ساعت 2 با غلظت 1 میلی مولار IPTG،D و E نتایج بعد از تخلیص و به صورت تک باند در محدوده 45 کیلو دالتون است، F نمونه ساعت صفر( بدون القاء)

4-8- نتایج تایید بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با روش وسترن بلاتینگ
.وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی منوکلونال ضد Histag یک باند در محدوده 45 کیلو دالتون را نشان داده است و تایید نمود که پلاسمید pET28a(+)/HPV پروتئین HPV واکسن کاندید چند اپی توپی را بیان می‌نماید.

شکل4-8: نتایج Western Blot و SDS-PAGE ، نتیجه در محدوده 45KD است.

شکل4-9: SDS-PAGE بعد از تخلیص انبوه پروتئین ، نتیجه به صورت تک باند و در محدوده 45KD است.
4-9-نتایج بررسی پاسخ های ایمنی همورال
4-9-1- نتایج بررسی سطح آنتی‌بادی توتال اختصاصی واکسن کاندید
نتایج بررسی سطح آنتی بادی توتال در گروههای تجربی نشان داده است که تزریق واکسن با ادجوانت فروند ناقص در دو نوبت بطور معنی داری سطح آنتی‌بادی‌های اختصاصی را در مقایسه با گروه کنترل افزایش داده است. بگونه ای که در رقت های 1/50 تا 1/3200 در مقایسه با گروه کنترل منفی اختلاف معنی داری را نشان داده است(0.015 p ).

نمودار 4-1: نتایج بررسی سطح آنتی بادی توتال در گروههای تجربی نشان داده است که تزریق واکسن با ادجوانت فروند ناقص در دو نوبت بطور معنی داری سطح آنتی‌بادی‌های اختصاصی را در مقایسه با گروه کنترل افزایش داده است. بگونه ای که در رقت های 1/50 تا 1/3200 در مقایسه با گروه کنترل منفی اختلاف معنی داری را نشان داده است(0.015 p ).

5-1- بحث و نتیجه گیری
ساخت یک واکسن فراگیر و همگانی برای پیشگیری از HPV به دلیل بعضی نواقص موجود در واکسن های HPV فعلی، یک نگرانی بزرگ است. توسعه واکسن مبتنی بر ساختار جدید که سروتایپ های کارسینوژنیک بیشتری را پوشش می دهد ممکن است سبب رهایی از پوشش محدود واکسن های HPV فعلی شود. آنالیز محاسبه ایی به عنوان روش راحت و سریع برای طراحی واکسن پپتید بکار برده می شود. شناسایی توالی هایی از آنتی ژن های ویروس که در اتصال به آنتی بادی ها نقش دارند، در بعضی کاربردهای بیومدیکال مانند طراحی واکسن، تشخیص بیماری و ایمنی درمانی مفید است. در حالی که تمایز تجربی اپی توپ های سلول B هزینه بر و وقت گیر است و روش غربالگری نرم افزاری یک جایگزین مطلوب ارائه می کند. در تحقیق فعلی، ما یک ساختمان منتخب چند اپی توپی با شش پوشش سروتایپ مهم به عنوان واکسن پپتید نسل جدید همگانی در نظر گرفته شد.
در اینجا چهار توالی پروتئینی HPV L1 , L2 پرخطر و دو مورد کم خطر برای پیش بینی اپی توپ با کمک روش های ایمونوانفورماتیک مختلف ارزیابی شدند. در انتها، بیست اپی توپ به عنوان کاندید برای طراحی ساختار نهایی انتخاب شدند و این پپتیدها بدون رابط بطور متوالی به هم متصل شدند.
یکی از مهمترین خصوصیات اپی توپ های انتخاب شده این است که آنها روی سطح هیدروفیلیک ویروس ها قرار دارند. این خصوصیات ابتدا در کارهای Novotny و همکارانش با محاسبۀ مساحت قابل دسترسی حلال باقیمانده های دخیل در پیوند آنتی ژن- آنتی بادی از پروتئین های مربوطه توضیح داده شد (181).
با توجه به اینکه در این مطالعه از پروتئین
های L1 و L2 به عنوان پروتئین های کاندید واکسن استفاده شد ،این پروتئین ها در سطح ویروس قرار دارند و پاسخ ایمنی همورال برای آن ها حائز اهمیت است بنابراین باید در نظر داشت که لنفوسیت های B تنها قادرند که اپی توپ های سطحی را شناسایی کنند (2) به

دسته‌ها: پایان نامه ها

دیدگاهتان را بنویسید