دانلود پایان نامه

انکوبه گردید.
پس از این مرحله سلول ها توسط سانتریفوژ در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه با دور 3000-2000 رسوب داده شده و به دنبال برداشتن کامل مایع رویی، رسوب در 1.16 حجم اولیه (2.5ml)بافر سرد کاملا حل شده و به طور استریل به میزان 200 میکرولیتر در لوله های میکروفیوژ (اپندورف) از قبل سرد شده ،در روی یخ تقسیم می شوند پس از تقسیم سلول های حساس در لوله های میکروفیوژ باید بلافاصله آنها را در ازت مایع یا دمای 70- درجه سانتی گراد و در صورت موجود نبودن در دمای 20- درجه سانتی گراد قرار داده و نگهداری کرد. به این ترتیب برای مدت 2-1 ماه این سلولها مستعد دریافت ژن می باشند.
3-9-ترانسفورم نمودن پلاسمید بیانی
مواد مورد نیاز:
– سلول صلاحیت دار (در اینجا E.coli سویه BL21 )
– پلاسمید بیانی
– محیط کشت LB مایع
– محیط کشت LB آگار (برای 1 لیتر)
Trypton یا Bactotryptone 10 گرم
Yeast Extract 5 گرم
NaCl 10 گرم
Agar 15 گرم
در آب دیونیزه به کمک مگنت حل و پس از به حجم رساندن با اتوکلاو استریل شد.
– آنتی بیوتیک مناسب(در اینجا کانامایسین 100µg/ml)
به این منظور با حل کردن 1g کانامایسین در 10ml آب مقطر استریل تزریقی یک استوک با غلظت 100mg/ml تهیه کرده و به ازای هر1ml از محیط کشت مقدار1gl از استوک آنتی بیوتیک اضافه می شود.
– لوله اپندورف و سر سمپلر استریل
Heat block با دمای 42 درجه سانتی گراد و انکوباتور 37 درجه سانتی گراد
روش کار:
در ابتدا با افزودن آنتی بیوتیک مناسب (در اینجا کانامایسین به منظور انتخاب سلول های ترانسفورم شده با پلاسمید های نوترکیب )، به LB آگار ذوب شده ،3 عدد پلیت حاوی محیط جامد اضافه شد.
سلول های مستعد به منظور ذوب تدریجی روی یخ قرار گرفته شد.
پلاسمید به اپندورف حاوی سلول های صلاحیت دار افزوده شد و به آرامی مخلوط گردید.
مخلوط حاصل را به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار گرفت.
اپندورف مذکور به heat block با دمای 42 درجه سانتی گراد و به مدت 90 ثانیه منتقل گردید (شوک حرارتی)، سپس بلافاصله 1 دقیقه روی یخ قرار گرفت.
به مخلوط فوق1ml محیط LB مایع اضافه شد ، سپس به مدت 1 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قرار گرفت.
*تمام این مراحل عینا برای نمونه کنترل منفی نیز انجام شد.
نمونه حاوی سلول های ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب و کنترل منفی روی پلیت های حاوی محیط جامد کشت داده شد.
100µl از سوسپانسیون میکروبی حاصل روی پلیت کاملا پخش شد و مابقی به مدت 5 دقیقه در 3000rpm سانتریفوژ شد. سپس محلول رویی دور ریخته شد و تقریبا 100µl از این محلول غلیظ شده روی پلیت دیگر و به طور مشابه کشت داده شد. 100µl از نمونه کنترل منفی نیز به طریق مشابه روی یک پلیت کشت داده شد.
پس از جذب سوسپانسیون میکروبی توسط محیط کشت ، پلیت ها را وارونه نموده ، برای تمام شب در 37 درجه سانتی گراد وارونه شد. روز بعد پلیت ها جهت ایجاد کلون مشاهده و بررسی می شوند.
*میزان DNA اضافه شده برای ترانسفورم حداکثر 50ng (10-50 ng) و به طور کلی نباید از 10 µl بیشتر شود . بنابر این میزان پلاسمید اضافه شده بستگی به غلظت آن دارد.
*در فرایند ترانسفورماسیون قرارگیری روی یخ باعث کاهش سیالیت غشا باکتری می شود و شوک حرارتی نفوذپذیری غشا را افزایش می دهد.
*در صورتی که پلیت ها از قبل تهیه شده و در یخچال نگهداری شده اند لازم است قبل از کشت در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قرار گیرند تا گرم شوند.
*کلیه مراحل در زیر هود و شرایط کاملا استریل انجام می شود.
*باکتری فاقد ژن مقاومت به آنتی بیوتیک است. بنابراین غربالگری سلول های ترانسفورم شده با ظهور کلونی بر روی پلیت حاوی آنتی بیوتیک انجام می گیرد.
3-10- SDS-PAGE
پس از جمع آوری باکتریهای ترانسفرم شده با پلاسمید نوترکیب و همچنین با پلاسمید غیر نوترکیب (به عنوان کنترل منفی) باکتری ها سه بار با بافر PBS در دور 300g شستشو داده شده. سپس به آن لودینگ بافر 5x اضافه شد و به مدت 7 دقیقه در آب جوش حرارت داده شد. سپس به مدت 10 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفوژ شده و از مایع رویی برای بررسی بیان استفاده گردید.
مواد مورد نیاز:
محلول آکریل آمید
Temed
آمونیوم پرسولفات
بافر تریس گلایسین
بافر نمونه
Set الکتروفورز
روش کار:
در ابتدا ژل متراکم کننده(Stacking or spacer gel) 10 درصد و ژل جداکننده (Resolving or separating gel) 15 درصد تهیه شدند.
پس از بسته شدن کامل ژل شیشه بر تانک الکتروفورز سوار گردید.
سپس بافر الکتروفورز را در محفظه های بالا و پایین ریخته و حباب های هوا با کمک سرنگ بزرگ خارج شد.
نمونه ها با بافر بارگذاری مخلوط شده و به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار داده شدند.
مقدار مناسب از نمونه ها و مارکر پروتئین درون چاهک ها ریخته شد.
ولتاژ دستگاه در ابتدا روی 80 و سپس روی 100 ولت تنظیم گردید.
پس از اتمام الکتروفورز فژل از روی صفحه شیشه ای برداشته شده و برای وسترن بلات اقدام گردید.
3-11-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس کم
برای بیان پروتئین نوترکیب HPV ، پس از تهیه باکتری های مستعد از میزبان بیانی، ترانسفورم این باکتری ها با پلاسمید PET28a(+)-HPV انجام شد و بیان پروتئین نوترکیب در آن به کمک IPTG یک میلی مولار القا گردید.
مواد و وسایل مورد نیاز:
1- باکتری بیانی E.coli BL21 DE3 .
2- محلول ها و ملزومات برای تهیه سلول های مستعد
3- محلول ها و ملزومات برای ترانسفورماسیو
ن
4- پلاسمید نوترکیب (در اینجا PET28a(+)-HPV )
*این پلاسمید طبق روش ذکر شده در قسمت های قبلی استخراج گردید.
5- آنتی بیوتیک مناسب
*کانامایسین(100µg/ml)
به این منظور با حل کردن 1g پودر کانامایسین در10ml آب مقطر استریل تزریقی ،یک استوک با غلظت 100mg/ml تهیه کرده و به ازای هر 1ml از محیط کشت مقدار 1µl از استوک آنتی بیوتیک اضافه شد.
6- محیط کشت LB مایع
7- محیط کشت LB آگار
8- محیط کشت 2xYT مایع
9- استوک IPTG(1M)(FermentaseTQiagen)
10- اسپکتروفتومتر
11-انکوباتور
12- سمپلر،سرسمپلر و فالکون استریل و اپندورف استریل
3-12-کشت انبوه سویه بیانی و تهیه جسم سلولی
پس از این مراحل که برای تایید و ارزیابی پروتئین تولید شده از یک کلونی انتخاب شده کشت انبوه در LB broth به مقدار 1 لیتر تهیه شد،القا با IPTG صورت گرفت و بعد از 4 ساعت از کل کشت جسم سلولی تهیه شد.در مرحله بعد از جسم سلولی باکتری‌ها به روش Denaturing وRefolding پروتئین ها تخلیص شدند.
3-13-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس بالا
کشت باکتری در یک لیتر محیط کشت انجام شد و پس از رسیدن به OD مناسب 8/0 و القاء با IPTG یک میلی مولار رسوب باکتریایی آن جمع آوری شد.
مواد و وسایل مورد نیاز:
1- استوک باکتری بیانی حاوی وکتور نوترکیب
2- محیط کشت مایع 2xYT به همراه گلوکز یک درصدحاوی 100 میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین(برای 1 لیتر)
3-IPTG (1mM)(Qiagen)
4- انکوباتور
5- سانتریفوژ
6- سرسمپلرفاپندورف و فالکون استریل

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   مقاله درمورد دانلودبرنامه اول توسعه، کارکنان بانک، قرن نوزدهم، صاحب نظران

روش کار:
1-مقدار lµ100 از استوک سلول های بیانی دارای وکتور نوترکیب موجود در 70- درجه سانتی گراد در10ml محیط کشت مایع 2xYT حاوی گلوکز یک درصدحاوی کانامایسین کشت داده شد و یک شب در انکوباتور 30 درجه سانتی گراد قرار گرفت.
2-صبحlµ2×300 از باکتری های کشت شب گذشته در 2×5ml محیط کشت مایع 2xYT حاوی گلوکز 1 درصد حاوی کانامایسین کشت داده شد و برای رشد باکتری و اشباع کامل محیط، حدود 3-2 ساعت در 30 درجه سانتی گراد انکوبه گردید.
3-هر یک از محیط های کشت 5ml اشباع شده به حجم 500ml رسید و مجددا برای رشد باکتری در 30 درجه سانتی گراد انکوبه گردید.
4-وقتی OD600 (جذب نوری در طول موج 600nm) در محیط کشت به 8/0 رسید، محتویات فوق به مدت 20 دقیقه در یخچال قرار گرفت.
5-پس از 20 دقیقه، 1ml از باکتری های فوق به عنوان نمونه قبل از القاء برداشت شد و مابقی باکتری با غلظت 1mM ازIPTG برای بیان پروتئین نوترکیب القاء شد و مجددا در انکوباتور 30 درجه سانتی گراد قرار گرفت.
6- حدود 6 ساعت بعد از القاء، نمونه های بعد از القاء نیز جمع آوری شدند. به نحوی که در هر فالکون 250ml کشت باکتری رسوب گیری شد. به این منظور رسوب گیری طی 5 بار سانتریفوژ برای هر فالکون انجام شد.
*برای برداشت نمونه های مذکور ،رسوب باکتریایی هر یک از کشت ها به مدت 5 دقیقه در 6000rpm سانتریفوژ گردید.
*این رسوب می تواند پس از خشک شدن در 20- درجه سانتی گراد نگهداری شود و یا مستقیما وارد مراحل تخلیص شود.
3-14-الکتروفورز پروتئین در ژل آکریل آمید در حضور SDS
SDS-PAGE روشی مناسب و سریع در مطالعه پروتئین ها می باشد و معمولا برای بررسی مراحل خالص سازی ، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن ملکولی پروتئین ها به کار می رود.
در این روش با استفاده از ژل پلی آکریل آمید (Polyacrylamide ) که پلی‌مری بی بار و غیر فعال از نظر شیمیایی است و سدیم دودسیل سولفات که دترجنتی آنیونی می باشد، پروتئین‌ها براساس وزن ملکولی خود تفکیک می گردند. با توجه به اندازه منافذ ژل پروتئین های کوچکتر با مزاحمت کمتر و پروتئین های بزرگتر با مشکل بیشتری حرکت می کنند و مسافت طی شده در پایان الکتروفورز با وزن ملکولی آنها تناسب دارد.این مسئله اساس تعیین وزن ملکولی در روش SDS-PAGE را تشکیل می‌دهد. SDS به مناطق آبگریز پروتئین ها متصل می شود و بار طبیعی آنها را می‌پوشاند در نتیجه بار منفی با تراکم مشابه در آنها ایجاد می‌کند. ماده احیا کننده‌ای هم که در بافر نمونه به کار می رود پیوندهای دی سولفیدی را شکسته و پروتئین کاملا باز می شود. بنابراین پروتئین ها بار منفی با تراکم مشابه یافته و در دامنه وسیعی از PH به طرف آند حرکت می کنند.
مواد و وسایل مورد نیاز:
محلول استوک آکریل آمید(30.8 درصد)
بالفر ژل پایین
بافر ژل بالا
بافر الکترود
پرسولفات آمونیوم(سیگما) 10 درصد در آب مقطر
بافر نمونه
تمد(سیگما) 10 درصد در آب مقطر
استاندارد وزن ملکولی (Fermentas)
منبع نیرو
تانک الکتروفورز عمودی
صفحات شیشه ای و فاصله اندازه ها
گیره
سرنگ هامیلتون
آب مقطر
روش تهیه محلول ها و بافرها
محلول استوک آکریل آمید(30.8 درصد)
30 گرم آکریل آمید و 0.8 گرم بیس آکریل آمید در آب مقطر تا حجم 100 میلی لیتر حل و با کاغذ واتمن صاف گردید(نگهداری در ظرف تیره و یخچال)
بافر ژل پایین:
18.2 گرم تریس باز و 0.4 گرم SDS در حدود 70 میلی لیتر آب مقطر حل گشته و با اسید کلریدریک به PH 8.8 رسید. سپس به حجم نهایی 100 میلی لیتر رسید.
3- بافر ژل بالا:
6.1 گرم تریس باز و 0.4 گرم SDS در حدود 50 میلی لیتر آب مقطر حل گشته و با اسید کلریدریک به PH 6.8 رسید.سپس به حجم نهایی 100 میلی لیتر رسید.
4- بافر الکترود:
3 گرم تریس باز ،14.4 گرم گلایسین و 1 گرم SDS در یک لیتر آب مقطر حل گردید.
5- بافر نمونه(5X):
10 میلی لیتر بافر ژل بالا ،5 میلی لیتر گلیسرول،1 گرم SDS ،0.2 میلی لیتر محلول برموفنل بلو(0.5 درصد در اتانل ) و یک میلی لیتر 2-مرکاپتواتانل مخلوط شده و با آب مق
طر به حجم 20 میلی لیتر رسیدند.
روش انجام SDS-PAGE :
محلول ژل پایین با غلظت 12.5 درصد و ژل بالا با غلظت 5 درصد بر اساس آماده گردید.
پس از آماده نمودن صفحات شیشه ای و ریختن ژل بالا و پایین ،شانه برداشته شده و آنها به تانک الکتروفورز متصل گردیدند و مخازن تا ارتفاع مناسب با بافر الکترود پر شد. نمونه پروتئین که با بافر نمونه 5 دقیقه در آب جوش قرار گرفته بود، به وسیله سرنگ هامیلتون در چاهک ها ریخته شدند.
الکتروفورز در ولتاژ ثابت 100 ولت انجام گرفت. در پایان ژل با دقت از میان صفحات شیشه ای

دسته‌ها: پایان نامه ها

دیدگاهتان را بنویسید