دانلود پایان نامه

ندارد.
فصل دوم
ادبیات و پیشینه تحقیق
2-1-مروری برمطالعات آنزیمی:
کشف آنزیمها در واقع به پژوهشهای وسیع پاپن و پرسوز47 وابسته بود. آنان در سال 1833 موفق شدند از جو سبز شده ترکیبی را به نام مالت کشف کنند که نشاسته را به قند مبدل میساخت و این ترکیب را دیاستاز48 نامیدند که امروزه به نام آنزیم آمیلاز49 معروف است ]71[.
بیشتر تاریخ بیوشیمی، تاریخ تحقیق آنزیمی است. کاتالیزور بیولوژیکی برای اولین بار در اواخر قرن 18 طی مطالعات انجام شده بر روی هضم گوشت توسط ترشحات معده انجام شد و بعدها بوسیله تبدیل نشاسته به قندهای ساده توسط بزاق ادامه یافت، لویی پاستور50 گفت که تخمیر قند به الکل توسط مخمر مایه کاتالیز میشود. بعد از پاستور، ادوارد بوخنر51 ثابت کرد که تخمیر توسط مولکولهایی تسریع میگردد که بعد از جدا شدن از سلولها، همچنان فعالیت خود را ادامه میدهند. فردریک کوهن52 این مولکولها را آنزیم نامید. جداسازی و کریستالیزه کردن آنزیم اورهآز53 در سال 1926 توسط جیمز سامند54 منجر به رفع موانع در مطالعات اولیه آنزیم شناسی گردید ]72 [.
آنزیمها از دوران قدیم مورد استفاده انسانها بوده اند، بدون اینکه فهمیده شود در کجا و چگونه عمل میکنند. از آنزیمها در تهیه انواع شیرینی، پنیر و مشروبات الکلی از دیر زمان، استفاده شده ولی کاربرد تجارتی آن از حدود سالهای 1890 میلادی آغاز شد. یعنی زمانی که از عصاره سلولهای قارچ به منظور تبدیل نشاسته به قند استفاده شد. همچنین آمیلاز و دیاستاز استخراج شده از قارچ از سال 1984 در آمریکا به عنوان مواد کمکی در هضم غذا کاربرد داشته است ]2[.
2-2-مروری بر پیشینه آنزیم لیپاز:
حدود 100 سال قبل میکروب شناسی به نام آیکمان55 برای اولین بار ترشح آنزیم لیپاز را توسط تعدادی از باکتریها گزارش نمود. پس از آن فعالیت لیپازها در محلولهای آلی مشاهده شد و مطالعات بر روی این آنزیم گسترش یافت، بطوریکه امروزه سالانه در حدود 1000 مقاله در این مورد منتشر میشود، همچنین لیپازها سهم برجستهای در بازار آنزیم دارند و پس از پروتئازها و آمیلازها رده سوم فروش جهانی را به خود اختصاص دادهاند ]32 [. تخمیر حالت جامد و تخمیر حالت غوطهور دو تکنولوژی رایج به منظور تولید آنزیمها و از جمله لیپاز محسوب میشوند. هر کدام از این روشها دارای مزایایی است که دیگری فاقد آن است ]37 [.
اولین بار در سال 1834 ابرل56 و در سال 1856 برنارد57 لیپاز موجود در پانکراس را شناسائی کردند و همراه آنزیم های پروتئاز و آمیلاز به عنوان یکی از سه آنزیم اصلی گوارش شناخته شد. اگر چه به علت مشکلات کار کردن با سوبسترای نامحلول و سیستم واکنش غیر یکنواخت به ندرت در تحقیقات مهم مورد بررسی قرار گرفته است [73].
امروزه “لیپازها” بیوکاتالیستهای مهمی هستند که واکنشهای با ارزشی را هم در محیط آبی و هم در محیط غیرآبی انجام میدهند. این خاصیت به خاطر قابلیت استفاده از طیف وسیعی از مواد به عنوان سوبسترا و مقاومت آنها در دماهای بسیار بالا، pH، حلالهای آلی و … می باشد. در میان لیپازهای گیاهی، حیوانی و میکروبی، لیپازهای میکروبی بیشترین کاربرد را دارند. زیرا میکروبها میتوانند براحتی کشت داده شوند و لیپازهای حاصل از آنها میتواند به راحتی طیف وسیعی از واکنشهای هیدرولیتیکی و سنتزی را کاتالیز کنند. لیپازها در زمینه های گسترده ای از علم بیوتکنولوژی به ویژه لبنیات (رسیدن پنیر، بهبود و توسعه طعم، تولید پنیر اصلاح شده آنزیمی (EMC،شوینده ها، مواد دارویی (ایبوپروفن، ناپروکسن)، مواد شیمیایی، کشاورزی (آفت کشها، حشره کش ها) و شیمی روغن (هیدرولیز چربی و روغن، سنتز بیوسورفاکتانت) کاربرد دارند. و در سالهای آینده در بسیاری از زمینههای جدیدتر به عنوان یک بیوکاتالیست بالقوه کاربرد خواهند داشت.
طبق مطالعاتی که محققان در طی این سالها انجام داده اند به این نتایج رسیده اند:
pH بهینه فعالیت و مقاومت حرارتی:
لیپازها مقاومت زیادی در7-6 pH نشان داده اند. و اکثرا قادرند در pH اسیدی و قلیایی تا 8 مقاومت نشان دهند. لیپازهای خارج سلولی قلیایی از A. niger, Chromobacterium viscosum و Rhizopus sp در pH اسیدی فعال و لیپاز از P. nitroreducens درpH، 11 فعال هستند. لیپازهای میکروبی به حرارت مقاوم هستند در حالیکه لیپازهای لوزالمعده فعالیت خود را در 40 درجه سانتیگراد از دست می دهند. لیپازهای A. niger, R. japonicus, C. viscosum در50 درجه سانتیگراد مقاوم هستند در حالیکه لیپازهای حاصل از میکروارگانیسمهای thermotolerant H. lanuginosa و P. sp. nitroreducens به ترتیب در 60 و 70 درجه سانتیگراد مقاوم هستند. بنابراین مقاومت حرارتی لیپازها متفاوت است.
لیپازهای میکروبی معمولاً از سلولهای تثبیت شده بدست میآیند. تثبیت سلولها را میتوان بهعنوان بستن فیزیکی یا موضعی ساختن سلولهای میکروبی در نظر گرفت. استفاده از سلولهای تثبیت شده بعنوان کاتالیستهای صنعتی در فرآیندهای پیوسته در مقایسه با فرآیندهای تخمیری ناپیوسته دارای مزایایی است. تکنولوژی تثبیت تمامی سلولها فواید عدیده ای در برابر تکنولوژی تثبیت آنزیم دارا میباشد. [33و34]
همچنین لیپازها به علت ویژگیهایشان مثل فعالیت در محدوده خاصی از دما و pH ، اختصاصی بودن سوبسترا، تنوع سوبستراو… بیوکاتالیستهای انتخابی در زمان حال و آینده میباشند و اهمیت آنها در صنایع مختلف مثل صنایع غذایی، دترجنت، صنایع شیمیایی و داروسازی روز به روز در حال افزایش است. آنزیم لیپاز سودوموناس یک سوش باکتریایی است، این آنزیم بیشترین فعالیت لیپولیتیکی را در pH های 6 و 9 نشان داد و بیشترین پایداری را درpH ، 8 داشت. به گونه ای که 65% فعالیت لیپازی در pH ، 8 مشاهده گردید. نتایج این پژوهش نشان داد که لیپاز سودوموناس یک لیپاز بالقوه قلیایی است و این لیپاز جهت کاربرد در بیوتکنولوژی مثل صنعت شویندهها میتواند مورد توجه قرار گیرد ]4[. لذا در این تحقیق از آنزیم لیپاز سودوموناس58 استفاده شده است.
در دهههای اخیر علاقه به تولید لیپاز میکروبی افزایش یافته است. همان طور که در فصل پیش آورده شد، این آنزیمها به دلیل تطابق ساختار مولکولی و خواص کاتالسیتیشان و همچنین طبیعت گزینش پذیر لیپازها در انتخاب محیط و مواد شیمیایی دارای کاربردهای بالقوهای در بخشهای مختلف صنعتی از قبیل صنایع غذایی، تصفیه فاضلاب، منسوجات، لوازم آرایشی، مواد افزودنی، مواد شیمیایی روغنی، داروسازی، پزشکی، شویندهها، چرمسازی و سوخت که از لیپاز به عنوان کاتالیست به منظور سنتز استرها و همچنین ترنس استریفیکاسیون روغن برای تولید بیودیزل بهره میگیرند، میباشد. همچنین لیپازها میتوانند در سنتز پپتید، تولید بیوسورفاکتانت و تجزیه مخلوطهای راسمیک مورد استفاده قرار گیرند. علاوه بر اینها یکی از کاربردهای محتمل لیپاز تجزیه زیستی پلاستیکهایی مانند پلی هیدروکسی آلکانوات (PHA) و پلی کاپرولاکتان (PCL) میباشد ]32-36[.
2-3-تاریخچه تولید کیتین و کیتوسان:
کیتین با نام علمی پلی ]بتا، (4?1)-2-استامید و -2- داکسی، D گلوکزپیرانوز[59 فراوانترین پلیمر زیستی طبیعی بعد از سلولز است، و از بههم پیوستن بیش از 5000 مونومر ان-استیل گلوکز آمین تشکیل میشود]74[. برای اولین بار در سال 1811 توسط شخصی به نام براکونات60 از یک نوع قارچ جدا شد که آن را فانجین61 نامید و پس از آن در سال 1823 اوردیر62، آن را از پوست یک نوع حشره جدا کرد ]65[ و دریافت که این ترکیب جزء اصلی پوسته خارجی بدن حشرات است و آنرا کیتین نامید. اسم این پلیمر زیستی نیز از واژه یونانی کیتون به معنی زره یا پوشش گرفته شده است. در سال 1859 راجت63، کیتین را در محلول غلیظ هیدروکسید پتاسیم جوشاند و برای اولین بار کیتوسان را تولید نمود]75[.
یکی از مهمترین ویژگیهای کیتوسان، تنوع اشکال (غشا، پودر، نانوذرات ، بید، فیبر و اسفنج ) آن میباشد، سنتز کیتوسان کربوکسیلدار شده، یکی از روشهای اصلاح فیزیکی کیتوسان میباشد. اندازه ذرات، پارامتری مؤثر در جذب سطحی میباشد. نتایج مطالعات نشان دادند که سرعت جذب سطحی با کاهش اندازه ذرات، افزایش مییابد و بهترین اندازه ذره برای جذب با کیتوسان، کوچکترین ذرات میباشد. نانوتکنولوژی امکان دستکاری مواد تا مقیاس نانو را فراهم کرده است و در این زمینه، سنتز نانوذرات به ویژه نانوذرات طبیعی پلی ساکاریدی به خاطر خواص زیست تخریب پذیری، آب دوستی و زیست سازگاری بسیار مورد توجه واقع گردیده است.
2-4-تاریخچه تثبیت آنزیم روی نانو ذرات:
جهت آماده سازی نانوذرات کیتوسان از روش ژل شدن یونی64 استفاده میشود. همچنین یکی از روشهای تهیه نانوذرات کیتوسان استفاده از مواد شبکه ای کننده مانند گلوتارآلدئید، گلی اکسال و اتیلن گلیکول از راه پیوند شیمیایی است. این مواد اگر چه عوامل شبکه ای کننده خوبی هستند اما به علت سمی بودن در کاربردهای زیستی قابل استفاده نیستند کیتوسان در محیط اسیدی به علت باردار شدن گروههای آمینی موجود در آن به به شکل پلی کاتیونی در آمده و میتواند با گونه های دارای بار منفی ماند سولفات و فسفات اتصال یافته و تولید ژل کند. ایجاد اتصالات فیزیکی از راه ایجاد نیروهای الکتروستاتیکی به جای استفاده از اتصالات شیمیایی برای جلوگیری از آثار نامطلوب شبکهای شدن شیمیایی، مورد توجه قرار گرفته است سدیم تری پلی فسفات (TPP) یکی از این مواد پلی آنیونی است که میتواند از راه برقراری نیروهای الکتروستاتیکی بین گروههای فسفات خود و گروههای آمینی کیتوسان به این پلیمر متصل شود. پس ار آن که بودمیر65 و همکاران تهیه کمپلکس Tpp – CS را از طریق چکاندن قطره های TPP در محلول کیتوسان گزارش کردند بسیاری از محققان این قابلیت را بررسی و از آن برای تهیه نانو ذرات کیتوسان در یک محلول اسیدی ضعیف حل میشود سپس این محلول با غلظت مناسب با محلول TPP در غلظت مشخص مخلوط میگردد. در اثر ایجاد کمپلکس بین یونهای با بار مخالف، کیتوسان به شکل ذرات کروی در آمده و محلول حالت کلوئیدی پیدا میکند برخی از این ذرات دارای ابعاد نانومتری هستند که باید از بقیه ذرات جدا شوند]76-79[.
برای تثبیت آنزیم لیپاز غالبا از پایه های متخلخل آلی استفاده شدهاست لیکن در سالهای اخیر انواعی از نانو ذرات، به عنوان گزینهای جدید برای تثبیت آنزیم و از جمله لیپاز مطرح شدهاند. زیرا نانو ذرات متخلخل به دلیل سطح تماس بالا و حجم بالای منافذ، ورود مولکولهای آنزیم را تسهیل نموده و فعالیت، استفاده مکرر، پایداری عملیاتی آنها را افزایش میدهد. لذا جهت بهبود و توسعه مصرف موثر و کاربردی لیپاز و نیز کاهش هزینههای تولیدی ( با توجه به استفاده مکرر از آنزیم) تکنولوژی تثبیت آنزیم نیز به کار گرفته شد.
تا کنون تثبیت لیپاز برروی انواعی از سیلیکاهای متخلخل مانند SAB-15,MCF, MCM48, MCM41 و اخیرا نیز در چندین مورد بر روی ذرات کتوسان صورت گرفته و بررسی شده است. در ادامه به بررسی تحقیقات انجام شده میپردازیم.
2-5-تحقیقات پیشین در این زمینه:
لی و همکاران در سال 2004 گزارش نمودند که مرحله کنترل دما در فرآیند جذب لیپاز روی بستر نانو سیلیکای متخلخل بسیار مهم است. با افزایش دما انتشار مولکولهای لیپاز آسانتر است. دمای بهینه برای بیشترین فعالیت آنزیم 45?C تشخیص داده شده است. افزایش دما سبب خروج پروتئین از حامل خواهد شد که موجب آسیب ساختاری لیپاز نیز میگردد.
کیم و همکاران در سال 2006 نانوذرات سیلیکا که با روش Stober تهیه شده بود را برای تثبیت آنزیم لیپاز موکور جاوانیکوس بکار گرفتند. نتایج انها نشان داد که فعالیت آنزیم تثبیت شده به مراتب بیشتر از آنزیم آزاد است ]90[.
در سال 2006 تانگ و

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید